黃經(jīng)春 孫立魁 孫曉霞 范春光 孫永超 濟(jì)南市衛(wèi)生學(xué)校；國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局濟(jì)南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，山東省生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （濟(jì)南 250101）

1.研究背景及意義

毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)中減少動(dòng)物使用已成為 趨勢(shì)[1]，新型生物材料重組人皮膚表皮的出現(xiàn)為皮膚刺激試驗(yàn)體外替代方法提供了載體[2]，ISO/TC194 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)技委會(huì)已準(zhǔn)備開展將重組人皮膚表皮應(yīng)用到醫(yī)療器械檢驗(yàn)的驗(yàn)證[3]。新型生物材料代替實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用到醫(yī)療器械檢驗(yàn)，能夠充分體現(xiàn)替代、減少、優(yōu)化的“3R”原則，在保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方面能夠發(fā)揮非常重要的作用?，F(xiàn)應(yīng)用重組人皮膚表皮模型EpiDerm?和家兔分別進(jìn)行醫(yī)療器械皮膚刺激試驗(yàn),比較兩種方法結(jié)果的一致性。

2.材料與方法

2.1 重組人皮膚表皮皮膚刺激試驗(yàn)

2.1.1 試驗(yàn)原理

對(duì)皮膚刺激陽(yáng)性對(duì)照1%十二烷基硫酸鈉(SDS)、陰性對(duì)照生理鹽水、棉籽油及受試物（某醫(yī)用敷貼按面積6:1 比例制備的浸提液[4]）分別作用于重組人皮膚表皮，接觸一定時(shí)間后用MTT 法測(cè)試細(xì)胞相對(duì)活性，如果細(xì)胞的相對(duì)活性≤50%，認(rèn)為受試物具有刺激性[5]。

圖1. EpiDerm ?試劑盒

圖2. 鏡下觀察組織病理

圖3. 重組人皮膚表皮皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.1.2 表皮模型

EpiDerm?試劑盒每盒包含有24 個(gè)表皮亞單位（見圖1）

2.1.3 試驗(yàn)方法

（1） 將液體受試物100μL 直接滴在表皮表面，在37?C5%CO2孵箱中孵育15min 之后，每塊表皮至少用10mLPBS 清洗一次，然后再孵育18h，讓受試物與組織充分作用。

（2） 將表皮與MTT 溶液在37?C5%CO2孵箱中孵育3h，避光放置，分離表皮和膠原基質(zhì)，在室溫中置于2mL 酸性異丙醇24h。

（3） 將萃取物（200μL）轉(zhuǎn)移到96 孔板，在570nm 測(cè)OD 值，酸性異丙醇為空白對(duì)照。對(duì)照表皮的OD 值必須界于0.6-0.9，并且1%SDS 處理的陽(yáng)性對(duì)照表皮的細(xì)胞活性在0-20%之間。

（4） 每個(gè)受試物需要作用于三個(gè)表皮，并用三個(gè)批號(hào)的皮膚模型產(chǎn)品。如果細(xì)胞的相對(duì)活性≤50%，則受試物具有刺激性。

2.1.4 重組人皮膚表皮皮膚刺激試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果

2.2 家兔皮膚刺激試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2.2.2 試驗(yàn)方法

家兔于試驗(yàn)前將背部脊柱兩側(cè)被毛除去(約10cm×15cm 區(qū)域)作為試驗(yàn)和觀察部位。將皮膚刺激陽(yáng)性對(duì)照1%SDS、陰性對(duì)照生理鹽水、棉籽油及受試物，某醫(yī)用敷貼按面積6:1 比例制備的浸提液分別浸透紗布敷貼接觸動(dòng)物皮膚，于接觸后24、48、72 小時(shí)，對(duì)接觸部位紅斑、水腫記分，將每只動(dòng)物在每一規(guī)定的時(shí)間試驗(yàn)材料引起的紅斑與水腫的原發(fā)性刺激記分相加后再除以觀察總數(shù)之和，用試驗(yàn)材料原發(fā)性刺激記分減去陰性對(duì)照的原發(fā)性刺激記分即為原發(fā)性刺激指數(shù)（PII），PII>0.4 認(rèn)為受試物具有刺激性[6]。

2.2.3 家兔法試驗(yàn)結(jié)果

家兔法測(cè)試1%SDS 陽(yáng)性對(duì)照原發(fā)性刺激指數(shù)PII 為5.6，陰性對(duì)照生理鹽水、棉籽油原發(fā)性刺激指數(shù)PII 均為0，醫(yī)用敷料浸提液（生理鹽水）、醫(yī)用敷料浸提液（棉籽油）原發(fā)性刺激指數(shù)PII均為0。

圖4. 新西蘭家兔

3.重組人皮膚表皮和家兔法皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果判定

表1. 重組人皮膚表皮和家兔法皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果判定

4.結(jié)論

1%SDS 處理的陽(yáng)性對(duì)照表皮細(xì)胞的相對(duì)活性為5%，具有刺激性。受試物和陰性對(duì)照細(xì)胞的相對(duì)活性均大于50%，表明受試物無(wú)刺激性。家兔法測(cè)試1%SDS 陽(yáng)性對(duì)照原發(fā)性刺激指數(shù)PII 為5.6，具有刺激性。受試物和陰性對(duì)照原發(fā)性刺激指數(shù)均為0，表明受試物無(wú)刺激性。重組人皮膚表皮與家兔試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果相一致，新型生物材料重組人皮膚表皮有望代替實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在醫(yī)療器械檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用。

5.討論

（1）家兔和人皮膚的生理特征存在差異，有些物質(zhì)在兔皮膚上表現(xiàn)出更強(qiáng)的毒性，家兔皮膚刺激性因敏感性過(guò)低而廣受責(zé)備。重組人皮膚表皮刺激試驗(yàn)采用表皮細(xì)胞直接接觸法更加敏感，且傳統(tǒng)皮膚刺激試驗(yàn)使用動(dòng)物數(shù)量多，具有刺激性的受試物給動(dòng)物帶來(lái)極大的痛苦，造成倫理方面的壓力，此方法若能通過(guò)國(guó)際間的驗(yàn)證形成標(biāo)準(zhǔn)并得到相關(guān)部門認(rèn)可和組織實(shí)施，新型生物材料重組人皮膚表皮將有望代替家兔在醫(yī)療器械檢驗(yàn)領(lǐng)域應(yīng)用，也將對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)事業(yè)做出巨大貢獻(xiàn)。

（2）我國(guó)醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)體外替代方法研究起步晚，發(fā)展慢，重組人皮膚表皮刺激試驗(yàn)在醫(yī)療器械檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用嘗試，為醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)替代方法提供了新的研究領(lǐng)域，我們應(yīng)盡快與國(guó)際接軌，采用更多的體外替代試驗(yàn)方法來(lái)取代傳統(tǒng)的動(dòng)物試驗(yàn)。

[1] 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第2 部分：動(dòng)物保護(hù)要求》GB/T16886.2-2000 idt ISO10993-2:1992

[2] Jo?o Barroso, The ECVAM validation of alternative tests for acute skin irritation

[3] J.W. Casas, In vitro human skin irritation test for evaluation of medical device extracts, Toxicology in Vitro 2013, 27 2175–2183

[4] 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第12 部分：樣品制備與參照樣品》GB/T16886.12-2005 idt ISO10993-12:2002

[5] 彭雙清 郝衛(wèi)東 伍一軍，毒理學(xué)替代法[M], 北京 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社2009

[6] 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第10 部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)》GB/T16886.10-2005 idt ISO10993-10:2002