徐 路，詹金熹，李 云，王曉俠，吳 瓊 (廣西師范大學(xué)，廣西 桂林 541004)

隨著世界經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，人們生活水平的不斷提高，心血管病成為各國(guó)高患病率和死亡率的主要疾?。?］。美國(guó)每年心肌梗死患者有760 萬(wàn)人，死亡人數(shù)超過12.5 萬(wàn)人。根據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部心血管病防治研究中心(NCCD)最新發(fā)布的中國(guó)心血管病2013 年度報(bào)告［2］，全國(guó)心腦血管疾病(高血壓、腦卒中、心肌梗死、心力衰竭等)患者約為2.9 億，每5 人中就會(huì)有1例是心血管疾病，發(fā)病人數(shù)還在持續(xù)增加。目前，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。利用成體干細(xì)胞可定向分化成心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞;另外自體移植不存在免疫排斥反應(yīng)。然而如何獲得足夠的自體心臟干細(xì)胞成為應(yīng)用于臨床的首要問題。因此建立一種可以大量高純度提取心臟干細(xì)胞的方法至關(guān)重要。本研究以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行了成體干細(xì)胞的分離提取及鑒定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)使用成年C57BL/6J 小鼠(2 ～3 月齡)購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號(hào):湘SCXK，2011-0003)。

實(shí)驗(yàn)試劑:Sca-1、CD45(美國(guó)eBioscience 公司);Lineage Cocktail with Isotype Ctrl(美國(guó)Biolegend 公司);7-AAD(Life invitrigen 公司);Anti-Sca-1/Ly6A/E antibody、Goat anti-Rat IgG H＆L(TRITC)Secondary antibody(英國(guó)Abcam 公司);膠原酶Ⅱ(Gibco 公司);DAPI(Sigma 公司);山羊血清、4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司);心臟干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基、心臟干細(xì)胞分化培養(yǎng)基(美國(guó)Millipore 公司)。

實(shí)驗(yàn)儀器:流式細(xì)胞分析儀(BD FACS Vaerse);流式細(xì)胞分選儀(BD FACS AriaⅡ);自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(TC100);恒溫CO2培養(yǎng)箱(HERAcell 240i);恒溫水槽(ZSBB-712);熒光倒置顯微鏡(Nikon Ti-S);多用途臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(labofuge400R);超凈工作臺(tái)(ESCO ACB-6A1)。

1.2 小鼠心臟細(xì)胞的分離

取小鼠斷頸處死，浸泡于75%乙醇中，用大頭針將小鼠固定于泡沫板上。用已滅菌的手術(shù)器械打開胸腔取出心臟，置于盛有肝素鈉的平皿中。在超凈工作臺(tái)中用預(yù)冷的PBS 反復(fù)沖洗除去殘留血液。將心臟轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，剪成1 ～2 mm3的小塊。每顆心臟加入2 mL 0.1%膠原酶Ⅱ，置于恒溫水槽37 ℃消化25 min，每隔5 min 取出吹打均勻。消化結(jié)束加入5 mL 培養(yǎng)液終止消化，過45 μm 細(xì)胞篩，4 ℃1 500轉(zhuǎn)離心5 min。棄掉上清加入培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 小鼠心臟細(xì)胞流式分析

將提取的單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到2 mL 微量離心管中，3 500 轉(zhuǎn)速離心5 min。在離心管上做好標(biāo)記:空白、Lin、CD45、Sca-1、Mix;空白管加入100 μL PBS 緩沖液，其他對(duì)應(yīng)加入100 倍稀釋的抗體PE anti-Mouse Lineage Cocktail、Anti-Mouse CD45 PerCP-Cy5.5、Anti-Mouse Ly-6A/E(Sca-1)PE-Cy7 以及三種混合的抗體。4 ℃避光孵育30 min。每管加入1 mL PBS 5 min 3 500 轉(zhuǎn)速離心。再分別加入1 mL PBS 重懸細(xì)胞準(zhǔn)備流式分析。額外準(zhǔn)備一管細(xì)胞7-AAD 孵育20 min，孵育后加入PBS 稀釋直接上流式檢測(cè)細(xì)胞活性。

1.4 小鼠心臟細(xì)胞流式分選

分選前鞘液筒滅菌，做好無(wú)菌分選的準(zhǔn)備。按上述1.3 方法處理細(xì)胞，利用流式細(xì)胞分選儀分選出Lin－CD45－Sca-1+細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞免疫熒光染色分析

將處理好的玻片放入24 孔板中，將分選出的細(xì)胞以5 ×104密度接種于孔板中，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。吸去培養(yǎng)基，PBS 洗3 次。加入封閉液37 ℃培養(yǎng)箱中封閉1 h。滴加特異性一抗Anti-Sca-1/Ly6A/E antibody，4 ℃過夜。用PBS 洗3 次，滴加二抗Goat anti-Rat IgG H＆L(TRITC)Secondary antibody，室溫孵育2 h。PBS 洗3 次，滴加DAPI 染核15 min。用PBS洗3 次，滴加封片劑。熒光顯微鏡下觀察。

1.6 分選細(xì)胞體外培養(yǎng)

將分選出的細(xì)胞以3 ×105密度接種于96 孔板中，分別加入心臟干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基和心臟干細(xì)胞分化培養(yǎng)基，2 ～3 d 半量換液1 次。

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞分析

將提取的單細(xì)胞懸液經(jīng)抗體孵育后直接用于Lin、CD45、Sca-1 表型鑒定，鑒定此方法分離的細(xì)胞中Lin－CD45－Sca-1+所占的比例(如圖1)，經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Lin－CD45－Sca-1+細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比例為(2.98 ± 1.23)%，每顆心臟中Lin－CD45－Sca-1+細(xì)胞數(shù)約為(1.76 ±0.68)×105。7-AAD 檢測(cè)細(xì)胞活性可達(dá)到80%以上(如圖2)。

2.2 分選細(xì)胞免疫熒光染色

在熒光顯微鏡下觀察，清楚地可以看到存在表型Lin－CD45－Sca-1+細(xì)胞(如圖3)，通過流式細(xì)胞儀無(wú)菌分選獲得的Lin－CD45－Sca-1+細(xì)胞純度可以達(dá)到90%。

2.3 分選細(xì)胞體外培養(yǎng)

將無(wú)菌分選的細(xì)胞接種96 孔板后，24 h 開始貼壁，心臟干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中20 h 左右可以看到小的克隆集落(如圖4)，隨后逐漸增大。心臟干細(xì)胞分化培養(yǎng)基中7 d 左右開始出現(xiàn)形態(tài)變化(如圖5)。

3 討 論

圖1 干細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定

圖2 7-AAD 檢測(cè)細(xì)胞活性流式圖

圖3 免疫熒光鑒定Sca-1 在分選的Lin －CD45 －Sca-1 +細(xì)胞中的定位，Blue 為核染，Red 為Sca-1(400 ×)

圖4 分選Lin －CD45 －Sca-1 +細(xì)胞體外培養(yǎng)形成的克隆集落，培養(yǎng)時(shí)間分別為:A 為1 d、B 為20 d、C 為30 d、D為40 d，高倍視野下觀察到的形態(tài)

圖5 分選Lin －CD45 －Sca-1 +細(xì)胞在正常培養(yǎng)基(A)和分化培養(yǎng)基(B)中培養(yǎng)，高倍顯微鏡下培養(yǎng)7 d 觀察到的細(xì)胞形態(tài)。

長(zhǎng)期以來，人們一直認(rèn)為心臟是一個(gè)終末分化器官，但事實(shí)并非如此。Kajstura 等［3］在共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)心臟組織中每100 萬(wàn)個(gè)心肌細(xì)胞有14 個(gè)細(xì)胞處于分裂狀態(tài)，當(dāng)患有原發(fā)性擴(kuò)張性心肌病和晚期缺血性心臟病時(shí)，處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)將會(huì)增加10倍。隨后Bearzi 等［4］在人的心肌組織中分離擴(kuò)增出c-kit+人的心臟干細(xì)胞(human cardiac stem cells，hCSCs)，多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它們具有人的心肌功能活性，可以自我更新、克隆增殖、定向分化，據(jù)此推斷心臟中存在心臟干細(xì)胞。Messina 等［5］從患者心房或心室活檢標(biāo)本中獲得樣品，通過體外培養(yǎng)收集到一些小、圓、亮的細(xì)胞，這些細(xì)胞可以克隆增殖，表達(dá)心臟干或祖細(xì)胞表面標(biāo)記;將其移植到小鼠心臟后分化為能夠收縮、表達(dá)心肌蛋白的肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，證實(shí)了人類心臟也存在心臟干細(xì)胞，并具有分化成心臟細(xì)胞系的潛能。隨著對(duì)成體心臟干細(xì)胞或祖細(xì)胞的研究，在多種哺乳動(dòng)物包括小鼠［6-7］、大鼠［8］和狗［9］以及人［4-5］心臟組織中都成功分離得到心臟干細(xì)胞或祖細(xì)胞。Sca-1(Stem cell antigen 1)是多種組織特異性干細(xì)胞的主要表面標(biāo)志分子［10］，也是目前較為常用的小鼠心臟干細(xì)胞標(biāo)志蛋白［11-14］。小鼠心臟干細(xì)胞表型分類很多，所占比例各不相同。本實(shí)驗(yàn)主要以抗小鼠Sca-1 抗體為核心，結(jié)合其他幾種抗體進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記。主要通過機(jī)械法剪碎組織和膠原酶Ⅱ消化過篩來獲取單細(xì)胞懸液，細(xì)胞存活率可達(dá)到80% 左右。造血細(xì)胞系列(Lineage，Lin)抗原作為分化細(xì)胞的標(biāo)志，白細(xì)胞共同抗原CD45 作為免疫細(xì)胞或血細(xì)胞的標(biāo)志，結(jié)合這兩種抗體可分選出Lin－CD45－Sca-1+細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比為(2.98 ±1.23)%，小鼠1 顆心臟中可成功分離出(1.76 ±0.68)×105個(gè)細(xì)胞。

目前常用的心臟干細(xì)胞的分離方法主要有兩種，組織塊培養(yǎng)法［5］和酶消化法［4］。利用原代組織塊培養(yǎng)的方法獲得心臟干細(xì)胞的周期較長(zhǎng)，需要在培養(yǎng)基中加入多種細(xì)胞因子;而用酶消化的方法可以在短期內(nèi)獲得足夠心臟干細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，比較來說酶消化法效率更高，目前已有多組其他實(shí)驗(yàn)室證明［4-6］。但關(guān)于酶的種類、酶的濃度以及酶的消化時(shí)間等方面都存在一定的差異，本實(shí)驗(yàn)室主要采用的是濃度為0.1%膠原酶Ⅱ消化25 min，經(jīng)過多次的實(shí)驗(yàn)確定利用這個(gè)條件獲得的效率更高。

以心臟干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道，Rota 等在大鼠體內(nèi)移植心臟祖細(xì)胞(cardiac progenitor cells，CPCs)或具有激活作用的細(xì)胞因子(GFs)，2 周后觀察到有新生的心肌細(xì)胞取代了約42%瘢痕組織，緩解了心室擴(kuò)張［15］;Williams 等通過體外誘導(dǎo)擴(kuò)增心臟干細(xì)胞(cardiac stem cells，CSCs)注入豬的心肌梗死心臟中，4 周后檢測(cè)到心肌梗死面積減少，提高了左室射血分?jǐn)?shù)［16］;Mohsin 等從心臟衰竭的患者體內(nèi)分離出CPCs 移植到小鼠心肌梗死區(qū)，超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)證實(shí)20 周后改善了心室結(jié)構(gòu)和功能，減小梗死區(qū)域，改善脈管系統(tǒng)［17］。但關(guān)于心臟干細(xì)胞如何維持自身穩(wěn)態(tài)、動(dòng)態(tài)變化規(guī)律以及定向分化相關(guān)影響因素和調(diào)控機(jī)制等方面的研究不夠清楚，仍需要進(jìn)一步研究，我們只有了解更多關(guān)于心臟干細(xì)胞的知識(shí)才能將干細(xì)胞療法更好的應(yīng)用于實(shí)踐。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的心臟干細(xì)胞提取方法，無(wú)菌分選可獲得足夠量的Lin－CD45－Sca-1+細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究，通過體外培養(yǎng)可進(jìn)一步了解心臟干細(xì)胞生物學(xué)特性，為心臟疾病的干細(xì)胞治療奠定基礎(chǔ)。

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