林 朔，李京向，陳寶元

(1.臨沂大學實驗中心，山東臨沂 276000;2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院肛腸科，北京 100700; 3.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中醫(yī)外科，天津 300150)

象皮對體外培養(yǎng)成纖維細胞作用研究

林 朔1，李京向△2，陳寶元3

(1.臨沂大學實驗中心，山東臨沂 276000;2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院肛腸科，北京 100700; 3.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中醫(yī)外科，天津 300150)

目的:通過鼠成纖維細胞株L-929體外培養(yǎng)實驗來研究象皮對成纖維細胞生長作用的影響。方法:通過體外培養(yǎng)小鼠成纖維細胞株L-929，并加入生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏的提取液，檢測藥物對細胞增殖和膠原分泌的影響。結果:生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏水提物在較高濃度下都能顯著促進成纖維細胞的增殖，生肌象皮膏相對于無象皮的生肌象皮膏促進細胞增殖的作用更為明顯。結論:象皮可明顯促進成纖維細胞的生長，從而促進創(chuàng)面愈合，證明象皮在生肌象皮膏中有重要作用。

象皮;生肌象皮膏;成纖維細胞;體外培養(yǎng);實驗研究

為從細胞分子生物學水平考察生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏兩種膏藥對瘡瘍愈合的療效，有必要建立體外研究模型。本實驗引入成纖維細胞培養(yǎng)的方法，通過體外培養(yǎng)小鼠成纖維細胞株L-929并加入生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏的提取液，檢測其對細胞增殖和膠原分泌的影響，從而判斷生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏對傷口愈合的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器

多功能微孔板分析儀，FlexStation 3，Molecular Devices公司，美國;CO2細胞培養(yǎng)箱，Thermo，美國;一次性針頭式濾器，0.22 μm孔徑，Millipore公司，美國;細胞培養(yǎng)瓶，96孔、6孔細胞培養(yǎng)板，50 ml離心管，Corning公司，美國。

1.2 材料

小鼠成纖維細胞株L-929自中國藥品生物制品檢定所引入;培養(yǎng)基采用含有L-谷氨酰胺及丙酮酸鈉配方的 DMEM高糖液體培養(yǎng)基(SH30243.01B，Hyclone公司，北京)，加入100 U/L青霉素，100 μg/ ml鏈霉素，10%胎牛血清(Bioind公司，以色列)，培養(yǎng)條件為37°C，5%CO2;2-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)，SigmaAldrich公司，美國;dimetylsulfoxide(DMSO)，Amresco公司，美國;Trypsin-EDTA溶液，SigmaAldrich公司，美國;羥脯氨酸測試試劑盒(酶消化法)，南京建成生物工程研究所;生肌象皮膏藥粉(批號0903026)，天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中藥制劑室;無象皮的生肌象皮膏藥粉(批號0903027)，天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中藥制劑室。

1.3 方法

1.3.1 生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏水提取物制備 稱取生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏藥物粉末各10 g，加入100 ml超純水室溫超聲提取1 h，連續(xù)2次，合并提取液，4℃、12000 rpm冷凍離心30 min，合并上清液，-20℃冷凍8 h，然后在冷凍干燥機內冷凍干燥，得到生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏水提取物。實驗前精密稱取適量，用MilliQ級超純水溶解，0.22 μm孔徑的一次性針頭式濾器過濾除菌備用。

1.3.2 成纖維細胞培養(yǎng) 從液氮中取出含有L-929細胞株的凍存管，迅速投入裝有37℃溫水的密封不銹鋼杯中，蓋上蓋子輕輕振搖使凍存液溶化，75%乙醇消毒凍存管表面后擰開蓋子，將含細胞的凍存液倒入50 ml聚丙烯離心管中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，輕搖混勻、密封，1000 r/ min離心5 min。倒掉上清液留下底部沉淀的細胞，加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹動培養(yǎng)基使細胞成均勻懸液，將細胞懸液種植在25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每48 h換液1次，培養(yǎng)72 h后細胞達到80%融合、傳代。

傳代方法為倒掉細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，少量Trypsin-EDTA溶液快速洗滌貼壁細胞表面，倒掉。加入2 ml Trypsin-EDTA溶液，37℃孵育3 min，待細胞成片脫落成流沙狀時，加入10 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液倒入50 ml聚丙烯離心管中密封，1000 r/min離心5 min。倒掉上清液，留下底部沉淀細胞，加入適量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，吸管輕吹培養(yǎng)基使細胞成均勻懸液，血細胞計數板計數，將細胞懸液種植到細胞培養(yǎng)瓶或細胞板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 細胞增殖實驗 將消化后重懸的 L-929細胞配成密度為1×105/ml的細胞懸液種植于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL的細胞懸液。培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后換液，換入含有生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏水提物的培養(yǎng)基。設置空白對照孔1組，6個平行孔。每組藥物濃度設置6個平行孔，在培養(yǎng)基中分別給予125 mg/L、250 mg/L、500 mg/L、1000 mg/ L濃度的生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏水提物。培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)18 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT PBS溶液10 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h吸出培養(yǎng)液，以PBS洗滌細胞表面1次，棄去液體計算加入100 μL的DMSO溶解細胞內生成的甲臜。在多功能微孔板分析儀上測定吸光度，設置檢測波長為570 nm。在L-929細胞培養(yǎng)液中加入生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏水提物，培養(yǎng)24 h后對細胞增殖活性的影響。

1.3.4 成纖維細胞分泌總膠原含量測定 將消化后重懸的L-929細胞配成密度為1×105/ml的細胞懸液，種植于6孔培養(yǎng)板中，每孔加入1 ml的細胞懸液。培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后換液，換入含生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏水提物的培養(yǎng)基。設置空白對照孔1組，4個平行孔。每組藥物濃度設置4個平行孔，在培養(yǎng)基中分別給予125、250、500 mg/L濃度的生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏水提物。培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h后，使用羥脯氨酸測試試劑盒，用消化法檢測L-929細胞總膠原的分泌量(以總膠原中的羥脯氨酸計算)。嚴格按試劑盒說明書操作，用FlexStation 3型酶標儀在550 nm處檢測吸光度A值，通過下列公式計算樣品中羥脯氨酸及總膠原含量。樣品中羥脯氨酸濃度(mg/L)=(測定孔A值-空白孔A值)/(標準孔A值-空白孔A值)。樣品中總膠原濃度(mg/L)=樣品羥脯氨酸濃度×7.46×稀釋倍數(7.46為從羥脯氨酸換算為膠原的計算常數)。

1.3.5 對體外培養(yǎng)成纖維細胞總膠原分泌量的影響 通過木瓜蛋白酶消化成纖維細胞及其細胞外基質，可以將細胞分泌總膠原中的羥脯氨酸游離出來。由于膠原中的羥脯氨酸含量固定，因此通常用測定羥脯氨酸含量的方法簡單間接測定膠原含量。在L-929細胞培養(yǎng)液中加入生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏水提物，培養(yǎng)48 h后用木瓜蛋白酶消化細胞計算細胞消化液中羥脯氨酸的濃度。利用羥脯氨酸與膠原的計算常數，計算出生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏水提物對L-929細胞總膠原蛋白分泌量的影響。

2 結果

2.1 生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏對體外培養(yǎng)成纖維細胞增殖的影響

表1顯示，生肌象皮膏水提物在500 mg/L和1000 mg/L濃度下，能顯著促進成纖維細胞增殖(P＜0.05)。無象皮的生肌象皮膏水提物在1000 mg/ L的濃度下，也能顯著促進成纖維細胞的增殖(P＜0.05)。在250 mg/L和500 mg/L的濃度下，生肌象皮膏水提物組的細胞活性明顯高于無象皮的生肌象皮膏水提物組的細胞活性(P＜0.05)。

表1 生肌象皮膏與無象皮生肌象皮膏對體外培養(yǎng)成纖維細胞增殖的影響(±s)

表1 生肌象皮膏與無象皮生肌象皮膏對體外培養(yǎng)成纖維細胞增殖的影響(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0.05;與同劑量無象皮的生肌象皮膏藥物水提物組比較:#P＜0.05

組 別 藥物濃度(mg/L) 細胞增殖活性OD(A570nm) 125 250 500 1000給藥組 生 肌 象 皮 膏 藥 物 水 提 物 0.8053±0.0135 0.8141±0.016# 0.8263±0.0111#* 0.8354±0.0128*無象皮的生肌象皮膏藥物水提物 0.7943±0.0125 0.7802±0.0093 0.7981±0.0139 0.8384±0.0095*對照組 空 白 組0.8164±0.0134

2.2 生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏對體外培養(yǎng)成纖維細胞總膠原分泌量的影響

表2顯示，生肌象皮膏水提物在125 mg/L和250 mg/L的濃度下，能顯著促進成纖維細胞的膠原分泌(P＜0.05)。生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏水提物在500 mg/L的濃度下，由于作用于L-929細胞的時間較長(48 h)，可能對細胞增殖有一定的抑制作用，因此膠原的分泌量相對于空白對照組和低濃度給藥組反而有所降低。

表2 生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏水提物對L-929細胞總膠原分泌量的影響(±s)

表2 生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏水提物對L-929細胞總膠原分泌量的影響(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0.05

組別 羥脯氨酸(μg/ml)總膠原蛋白(μg/10000個細胞)空 白 對 照 組3.5451±0.3283 0.7934±0.0735無象皮生肌象皮膏125mg/L 3.4357±0.6039 0.7689±0.1352無象皮生肌象皮膏250mg/L 3.8203±0.4906 0.8550±0.1098無象皮生肌象皮膏500mg/L 2.5603±0.4016 0.5730±0.0899生肌象皮膏1 2 5 mg/L 4.3143±0.3080*0.9656±0.0689*生肌象皮 膏2 5 0 mg/L 4.2082±0.2769*0.8609±0.1695*生肌象皮膏5 0 0 mg/L 2.7670±0.4998 0.6917±0.1713

3 討論

中醫(yī)外用藥物有著悠久的歷史。清代名醫(yī)徐靈胎曾謂:“用膏貼之，閉塞其氣，使藥性從毛孔而入其腠理，通經貫絡或提而出之，或攻而散之，較之服藥尤有力，此至妙之法也?！鄙∠笃じ嗍侵嗅t(yī)外科最具有生肌長皮作用的外用藥代表之一，最早出自于張山雷的《瘍科綱要》一書，由象皮粉、當歸、血余炭、龜板、生地、生爐甘石、生石膏、香油、白蠟組成。方中以象皮粉、生石膏、爐甘石、血余炭為主藥，配以滋陰養(yǎng)血、活血化瘀收斂之品，共奏生肌長皮、活血養(yǎng)血之功。

生肌象皮膏用于治療各種瘡瘍疾病，在潰瘍期膿腐基本已凈而皮不生肉不長時應用最佳，多年來生肌象皮膏廣泛治療各種疾病療效確切，如有效治療各種慢性潰瘍、皮膚損傷、感染傷口及骨髓炎、褥瘡、燒傷、糖尿病足病等都有很好的療效。

因生肌象皮膏的主藥象皮來自于亞洲大象的皮膚故正品缺貨?！吨腥A人民共和國野生動物保護法》2004年修正版明確規(guī)定，禁止獵捕、殺害與交易大象。此外我國2005版《中藥大詞典》已明確將象皮從該藥物中剔除，所以造成臨床生肌象皮膏無象皮可用的局面，故象皮在生肌象皮膏中的作用和地位及其代用品研究就顯得十分迫切和重要。如臨床與實驗證實，象皮在生肌象皮膏中具有重要的作用和地位，那么就可進一步開展象皮的代用品研究。

成纖維細胞的增殖及細胞分泌膠原的能力，一直是學術界評價皮膚再生及修復重建的通用標準。所以本實驗為驗證象皮在生肌象皮膏中具有重要的作用和地位，故引入成纖維細胞培養(yǎng)的方法，通過體外培養(yǎng)小鼠成纖維細胞株L-929，并加入生肌象皮膏與無象皮的生肌象皮膏提取液，檢測兩者對細胞增殖和膠原分泌的影響。研究證實，生肌象皮膏促進細胞增殖、成纖維細胞分泌膠原的作用更為明顯，進一步證明對于促進皮膚的正常結構修復，象皮起到了必不可少的重要作用，說明象皮在生肌象皮膏中確實具有重要作用和地位。因此，尋找療效相當且能替代象皮的中藥、研發(fā)象皮代用品、保證生肌象皮膏繼續(xù)為患者解除疾苦迫在眉睫。

Research of Elephant Skin Effect on Fibroblasts in Vitro

Objective:Study the Elephant Leather effect on fibroblast growth by the culture of Mouse fibroblast cell line L-929.Methods:Having vitro cultured mouse fibroblast cell line L-929，studied on the cell proliferation and collagen secretion by joined extract drugs of Sheng Ji Xiang Pi Ointment and Sheng Ji Xiang Pi Ointment without elephant leather respectively.Result:The water extract drugs of Sheng Ji Xiang Pi Ointment showed better in promoting the proliferation of fibroblasts than the Sheng Ji Xiang Pi Ointment without elephant leather at higher concentrations，and then Sheng Ji Xiang Pi Ointment can promote to proliferate more quickly than the Sheng Ji Xiang Pi Ointment without elephant leather. Conclusion:Elephant Leather significantly promote the growth of fibroblasts，promote wound healing，thereby Elephant leather had an important role in Sheng Ji Xiang Pi Paste.

Elephant Leather;Sheng Ji Xiang Pi Ointment;Fibroblast Cell;Vitro Culture;Experimental Study

R961

:B

:1006-3250(2015)09-1102-03

2015-03-08

林 朔(1971-)，女，醫(yī)學本科，從事中藥外用對動物創(chuàng)面愈合的影響研究。

△通訊作者:李京向(1970-)，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事中醫(yī)外科、肛腸疾病、瘡瘍病的臨床與應用研究，Tel: 13436387039，E-mail:bjbjljx2011@126.com。

LIN Shuo1，LI Jing-xiang2△，CHEN Bao-yuan3

(1．Experimental Center，Linyi University，Shandong，Linyi 276000，China;2．Dongzhimen Hospital Affilicated to the Beijing University of Traditional Chinese Medicine，surgery department of Anal，Beijing 100700，China; 3．The Second Hospital affiliated to Tianjin University of TCM，surgery department of TCM，Tianjin 300150，China)