宋遠(yuǎn)圓　殷寒秋　殷松樓

摘要：目的 觀察丹參川芎嗪對博來霉素所致間質(zhì)性肺病大鼠肺組織病理變化及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）表達(dá)的影響。方法 45只SD雄性成年大鼠隨機(jī)分為對照組模型組和丹參川芎嗪治療組（治療組），每組15只。模型組、治療組經(jīng)氣管一次性滴注博來霉素（5mg/kg）0.2ml～0.3ml復(fù)制間質(zhì)性肺病大鼠模型；對照組經(jīng)氣管滴注同體積生理鹽水；造模后第1 d起，治療組每日經(jīng)腹腔注射丹參川芎嗪2ml/kg，對照組及模型組每日經(jīng)腹腔注射同等體積生理鹽水。于第28 d處死各組大鼠，取肺組織行蘇木素-伊紅（HE）染色和Masson染色觀察肺臟組織病理變化；免疫組織化學(xué)法檢測肺組織TNF-α、NF-κB的表達(dá)；堿樣本水解法測定肺組織中羥脯氨酸含量。結(jié)果 ①對照組未見明顯炎癥、膠原沉積及纖維化改變；模型組可見明顯肺泡炎癥、膠原沉積、纖維化改變，TNF-α、NF-κB表達(dá)明顯增高；②治療組肺泡炎和肺纖維化程度均較模型組輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；③治療組肺組織中TNF-α、NF-κB的表達(dá)較模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；④治療組羥脯氨酸（hydroxyproline）含量較模型組減少（P<0.05）。結(jié)論 TNF-α、NF-κB在模型組大鼠肺組織中水平明顯降低，提示丹參川芎嗪改善大鼠肺間質(zhì)性病變可能與抑制肺組織TNF-α、NF-κB表達(dá)、抑制膠原沉積有關(guān)。

關(guān)鍵詞：丹參川芎嗪；肺間質(zhì)疾病；博來霉素；TNF-α、NF-κB；羥脯氨酸

間質(zhì)性肺?。╥nterstitial lung disease，ILD）是一組主要累及肺間質(zhì)、肺泡及細(xì)支氣管的肺部彌漫性疾病，病因未明，可以是原發(fā)的，也可以繼發(fā)于多種疾病、某些藥物及石棉、粉塵等，其中結(jié)締組織病是繼發(fā)性間質(zhì)性肺病最常見病因。ILD病變進(jìn)展快，死亡率高，其共同的病理特征為不同程度的炎癥及纖維化表現(xiàn)，最終可進(jìn)展為肺纖維化（pulmonary fibrosis），該病目前缺乏有效的治療手段，主要治療藥物糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑，不良反應(yīng)多且部分患者對治療反應(yīng)差，隨病情遷延，可出現(xiàn)呼吸衰竭、嚴(yán)重感染、心血管疾病等，是患者死亡的重要原因。在ILD發(fā)病機(jī)制研究中，多種細(xì)胞因子參與的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)是研究的熱點(diǎn)。TNF-α作為一種前炎癥細(xì)胞因子，在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中調(diào)節(jié)刺激其他細(xì)胞因子共同介導(dǎo)肺泡炎，在肺泡炎進(jìn)展為肺纖維化過程中發(fā)揮重要作用[1]。NF-κB家族是具有多向轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白，存在于多種細(xì)胞中，其激活后可使細(xì)胞合成并釋放大量炎性介質(zhì)，進(jìn)而刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原纖維[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)丹參、川芎嗪在抗炎、抗纖維化方面有重要作用[3]。本研究觀察丹參川芎嗪對博來霉素誘導(dǎo)間質(zhì)性肺病大鼠肺組織病理變化的影響，探討丹參川芎嗪ILD發(fā)生中的治療作用及可能機(jī)制。

1資料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物與藥物 雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量200～230g，由徐州醫(yī)學(xué)院動物中心提供。平陽霉素（BLM-A5，天津太河藥業(yè)有限公司），丹參川芎嗪注射液（貴州拜特制藥有限公司）。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗鼠TNF-α多克隆一抗抗體，兔抗鼠NF-κB多克隆一抗抗體，羊抗兔SP試劑盒，濃縮型DAB試劑盒（均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司），羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所），Masson染色試劑盒（南京凱基生物工科技公司）。

1.1.3實(shí)驗(yàn)器材 Multiskan Spectrum全波長酶標(biāo)儀（Thermo Scientific公司），普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動物分組與造模 將45只SD雄性成年大鼠在實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分為3組：對照組、模型組和治療組，每組15只。參照文獻(xiàn)[4-5]進(jìn)行造模。模型組、治療組用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定于置于手術(shù)平板上，將手術(shù)平板置于45度傾斜，采用口-氣管插管法，將16 G腰穿針經(jīng)口-聲門插入氣管，連接1 ml注射器，緩慢注入博來霉素生理鹽水溶液（5 mg/kg）約0.2 ml～0.3 ml，繼續(xù)注入0.3 ml的空氣，注后立即將動物直立并左右旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布。

1.2.2藥物干預(yù) 對照組大鼠同樣方法注入等體積的生理鹽水。造模后對照組和模型組每日予生理鹽水約2 ml/kg腹腔注射，治療組每日經(jīng)腹腔注射丹參川芎嗪注射液（2 ml/kg）。各組分別于氣管內(nèi)注藥后第28 d各處死大鼠。

1.2.3肺組織標(biāo)本收集 將大鼠稱重后，以10%水合氯醛（0.3ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，固定于鼠手術(shù)板上，經(jīng)腹主動脈放血法處死大鼠。取左肺組織放于4%多聚甲醛溶液固定。隨機(jī)在不同部位取材3塊，石蠟包埋，制作成3 μm厚的切片。同時(shí)收取右肺組織-80℃保存，測羥脯氨酸含量。

1.3指標(biāo)檢測

1.3.1免疫組織化學(xué)檢測 TNF-α、NF-κB的表達(dá)一抗分別為兔抗鼠TNF-α多克隆抗體、NF-κB多克隆抗體，稀釋度為1：200，二抗為HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，按免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)在高倍鏡視野（×400）下隨機(jī)取10個(gè)視野，測量細(xì)胞中陽性顆粒的平均光密度（OD），計(jì)算各平均值。

1.3.2肺組織羥脯氨酸含量測定 準(zhǔn)確稱量肺組織標(biāo)本100mg，采用堿水解法檢測各組大鼠肺組織中羥脯氨酸的含量，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3肺組織病理學(xué)檢查 光學(xué)顯微鏡下觀察肺泡炎和肺纖維化，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，根據(jù)Szapiel等[6]方法確定。肺泡炎分為4級：無肺泡肺炎0分；輕度肺泡肺炎1分；中度肺泡肺炎2分；重度肺泡肺炎3分。肺間質(zhì)纖維化分級標(biāo)準(zhǔn)：無纖維化0分；輕度肺纖維化1分；中度肺纖維化2分；重度肺纖維化3分。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠一般行為改變 對照組大鼠體重增加，喜活動，毛發(fā)光澤。模型組和治療組大鼠在造模后出現(xiàn)活動減少，精神差，飲食及飲水減少，毛發(fā)無光澤，體重下降，并出現(xiàn)呼吸急促、咳嗽及撓鼻等呼吸系癥狀，其中模型組大鼠上述表現(xiàn)最明顯，治療組大鼠一般狀況較B組好，體重下降不明顯，7 d后飲食及飲水較前增加，體重有所上升。

2.2大鼠肺組織形病理情況 模型組大鼠肺組織HE染色可見第28天肺泡結(jié)構(gòu)破壞，支氣管壁及其周圍，血管周圍及肺間質(zhì)可見膠原形成、纖維化，見圖1；Masson染色可見明顯的藍(lán)色膠原纖維。治療組肺泡炎及纖維化程度均較模型組減輕，見圖2。

圖1 各組大鼠肺組織病理改變（蘇木精-伊紅染色，×200）

注：A、B、C分別代表對照組、模型組、治療組。

圖2 各組大鼠肺組織病理改變（蘇木精-伊紅染色，×200）

注：A、B、C分別代表對照組、模型組、治療組。

3組動物肺組織炎癥評分的比較對照組無明顯炎癥反應(yīng)，治療組炎癥反應(yīng)較對照組重，但較模型組明顯減輕（P<0.05），見表1。

3組動物肺組織纖維化評分的比較對照組無明顯纖維化；治療組纖維化程度較對照組較重（P<0.05），但較模型組明顯減輕（P<0.05），見表1。

2.3免疫組化檢測各組大鼠肺組織TNF-α表達(dá) 肺組織中TNF-α主要在胞質(zhì)表達(dá)，并主要分布于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡I型上皮細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞。模型組肺組織TNF-α的表達(dá)較對照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療組肺組織TNF-α的表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但低于模型組（P<0.05），見表2，圖3。

圖3 各組大鼠肺組織TNF-α免疫組化染色（×200）

注：A、B、C分別代表對照組、模型組、治療組。

2.4免疫組化檢測各組大鼠肺組織NF-κB表達(dá) NF-κB主要在胞核表達(dá)，模型組大鼠肺組織NF-κB較對照組及治療組表達(dá)明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療組肺組織NF-κB的表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但低于模型組（P<0.05），見表2，圖4。

圖4 各組大鼠肺組織NF-κB免疫組化染色（×200）

注：A、B、C分別代表對照組、模型組、治療組。

2.5肺組織羥脯氨酸含量與對照組比較 模型組及治療組肺組織羥脯氨酸含量較對照組均明顯增加（P<0.05）；與模型組相比，治療組大鼠肺組織羥脯氨酸含量明顯降低（P<0.05），見表3。

3討論

ILD常由早期的肺泡炎進(jìn)展到肺纖維化，病死率高，早期診斷和治療是阻斷ILD進(jìn)展的關(guān)鍵[7]。ILD確切的發(fā)病機(jī)制及病因尚未完全明確，其中對于細(xì)胞因子在ILD發(fā)生發(fā)展過程中的作用研究較為深入。近年來表明TNF-α在ILD患者及動物模型中均有高表達(dá)[8-10]。TNF-α是一種多效性細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等方面有重要作用。TNF-α可導(dǎo)致炎癥、細(xì)胞壞死、新血管的形成，并可促進(jìn)內(nèi)皮素-1的產(chǎn)生而引起血管壁的損傷。作為重要的前炎癥細(xì)胞因子，TNF-α可以促進(jìn)lL-1、IL-2、IL-6、CCL2、PDGF、TGF-β1等細(xì)胞因子產(chǎn)生及分泌，觸發(fā)肺泡上皮細(xì)胞的"瀑布式"炎癥級聯(lián)反應(yīng)，而TGF-β1作為肺纖維化的始動因素，是目前已知最強(qiáng)的促纖維化因子[10]。胡玉潔等[11]觀察TNF-α的特異性阻斷劑依那西普可直接阻斷MAPKs信號通路，同時(shí)可通過下調(diào)TGF-β1的表達(dá)抑制MAPKs的活化從而阻斷肺纖維化的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)中，在模型組大鼠肺組織中早期即可發(fā)現(xiàn)TNF-α的表達(dá)，在第28 d，模型組大鼠肺組織TNF-α表達(dá)仍明顯高于對照組及治療組，肺泡炎及肺纖維化程度較對照組及治療組重，提示TGF-β1在肺泡炎的發(fā)生及由肺泡炎進(jìn)展為肺纖維化的過程中發(fā)揮重要作用。NF-κB是研究較多的核轉(zhuǎn)錄因子，其能介導(dǎo)TNF-α觸發(fā)過度的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞存活率明顯降低[12]。本實(shí)驗(yàn)中，NF-κB在對照組肺組織中偶有表達(dá)，在模型組中，表達(dá)明顯增多，主要表達(dá)于肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞及炎癥細(xì)胞核中，提示肺組織高表達(dá)NF-κB與肺組織纖維化形成關(guān)系密切。羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）是膠原蛋白所特有的氨基酸，通過對肺組織中羥脯氨酸含量的測定，可以了解其膠原蛋白分解代謝狀況，因此測定HYP的含量常被用于肺纖維化的研究。本實(shí)驗(yàn)Hyp含量測定表明，對照組相比，模型組及治療組肺組織中Hyp含量增高，而治療組中Hyp含量低于同時(shí)期模型組，提示丹參川芎嗪能調(diào)節(jié)肺組織中膠原代謝，減輕肺組織膠原沉積，從而起到減輕肺纖維化的作用。

近年來，丹參聯(lián)合川芎治療肝纖維化、肺纖維化、腎臟纖維化及心肌纖維化等方面均有報(bào)道。丹參的主要功效為祛瘀止痛，活血通經(jīng)，丹參能顯著抑制白細(xì)胞聚集，減少肺內(nèi)活性物質(zhì)的產(chǎn)生，從而減輕肺損傷。有研究表明丹參可抑制NF-κB的活化，減少細(xì)胞因子炎癥介質(zhì)的合成與釋放，減少成纖維細(xì)胞的活化[13]。丹參可以增加Fas及Bax的表達(dá)并降低Bcl-2的表達(dá)，促使成纖維細(xì)胞凋亡[14]，而起到抗肺纖維化的作用。川芎嗪可直接清除具有細(xì)胞毒性作用的自由基，抗脂質(zhì)過氧化，具有改善微循環(huán)、擴(kuò)張小動脈、拮抗鈣離子的作用，能抑制成纖維細(xì)胞分裂、增殖，從而起到抗組織損傷和防治肺纖維化作。川芎嗪可通過作用于TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，下調(diào)TGF-β1和Smad2/3的表達(dá)發(fā)揮抗纖維化的作用[15]。在高糖所致的慢性腹膜炎大鼠模型中，川芎嗪可拮抗大鼠腹膜間皮細(xì)胞MCP-1和NF-κBp65的表達(dá)，減輕腹膜慢性炎癥，延緩腹膜纖維化的發(fā)生。丹參與川芎嗪既有相似的藥理作用，又有各自不同的作用靶點(diǎn)，兩者聯(lián)合應(yīng)用可減少單藥用藥劑量，降低毒副作用。本實(shí)驗(yàn)中，我們經(jīng)氣管一次性滴注博來霉素復(fù)制間質(zhì)性肺病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間變化，模型組大鼠肺組織病理顯示從肺泡炎逐漸變?yōu)榉伍g質(zhì)纖維化，說明間質(zhì)性肺病動物模型復(fù)制成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比較，治療組TNF-α、NF-κB表達(dá)明顯減少，Hyp含量減低，結(jié)合病理學(xué)變化，提示腹腔注射丹參川芎嗪合劑能明顯改善博來霉素所致的肺泡炎，減輕炎癥浸潤，抑制TNF-α、NF-κB合成和分泌，抑制膠原沉積，從而減少成纖維細(xì)胞的增殖與活化，改善肺間質(zhì)性病變的預(yù)后。

總之，丹參聯(lián)合川芎嗪能減輕肺纖維化程度，其機(jī)制可能通過抑制TNF-α及NF-κB的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，對肺纖維化的發(fā)生有一定預(yù)防作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]張曉.腫瘤壞死因子及轉(zhuǎn)化生長因子在肺間質(zhì)病變發(fā)病機(jī)制中的作用[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2010，14（1）：13-16.

[2]趙印敏.博萊霉素誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞過程中核轉(zhuǎn)錄因子-κB對核因子相關(guān)因子信號通路的調(diào)控機(jī)制[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2014，31（8）：1650-1653.

[3]陳媛媛.丹參聯(lián)合川芎嗪對肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1表達(dá)及羥脯氨酸含量的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國學(xué)，2012，23（5）：1121-1124.

[4]De Vooght V，Vanoirbeek JA，Haenen S，et al.Oropharyngeal aspiration：an alternative route for challenging in a mouse model of chemical-induced asthma[J].Toxicology，2009，259（1）：84-89.

[5]陳恩，俞曉青，魯亞男，等.大鼠頸部透照法經(jīng)口氣管插管技術(shù)[J].上海實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)，2003，23（3）：240-241.

[6]Szapiel SV，Elson NA，F(xiàn)ulmer JD，et al.Bleomycin induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis，1979，120：893-897.

[7]Solomon JJ，F(xiàn)ischer A.Connective Tissue Disease-Associated Interstitial Lung Disease：A Focused Review[J].Journal of Intensive Care Medicine，2013，10（15）：1-9.

[8]何霞琴，劉學(xué)軍.腫瘤壞死因子-α在肺纖維化大鼠模型中的動態(tài)表達(dá)和意義[J].臨床醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，19（5A）：330-334.

[9]MS Wilson，TA Wynn.Pulmonary fibrosis：pathogenesis，etiology and regulation[J].Mucosal Immunol，2009，2（2）：103-121.

[10]胡玉潔.依那西普抑制博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[J].中國病理生理雜志，2013，29（6）：1034-1038.

[11]吳煒景.NF-κBp65基因在TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞氧化損傷中的作用[J].中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2012，11（1）：46-51.

[12]吳宗輝.丹參素對IL-1β刺激的大鼠肝星狀細(xì)胞JNK、NF-κB信號通道的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29（5）：914-917.

[13]朱鴻明，鄧力.丹參對缺血性心肌損傷的抗凋亡作用[J].華西藥學(xué)雜志，2010，25（2）：236-239.

[14]陳爽.川芎嗪對大鼠肝纖維化轉(zhuǎn)化生長因子β-Smad2/3表達(dá)的影響[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2013，22（10）：970-973.

[15]甘平，翟小江.川芎嗪對高糖致大鼠腹膜間皮細(xì)胞MCP-1和NF-κBp65表達(dá)的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（15）：1633-1636.

編輯/申磊