涂容芳，曾賽麗，何振華，譚小武，陳 哲，夏葉舟，李雪花

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)起病隱匿、進(jìn)展迅速、病死率高，嚴(yán)重危害人類健康。多種因素參與了IPF發(fā)生發(fā)展的過程，其中“損傷修復(fù)”機(jī)制受到高度關(guān)注[1]。近年來研究[2]表明，TGF-β1介導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程在“損傷修復(fù)”過程具有重要作用。H2S是近年來被廣泛關(guān)注的一種新型氣體信號分子，其抗肺纖維化作用已得到包括本實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)的國內(nèi)外多個研究小組的確認(rèn)，但具體機(jī)制尚未闡明[3]。本實(shí)驗(yàn)用博來霉素(bleomycin，BLM)氣管內(nèi)給藥復(fù)制肺纖維化模型，采用外源性NaHS作為H2S供體，通過比較H2S干預(yù)前后大鼠肺組織中TGF-β1及EMT過程相關(guān)指標(biāo)E-鈣黏素(E-cadherin，E-cad)、波形蛋白(vimentin，VIM)、α-平滑肌蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)變化，從而探討H2S對肺纖維化EMT過程作用機(jī)制，為靶向治療肺纖維化提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠60只，7～8周齡，體質(zhì)量280～300 g，購買于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)許可證號：SCXK[湘]2014-0011)，動物飼養(yǎng)于南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部(使用許可證號：SYXK[湘]2020-0002)。實(shí)驗(yàn)方案通過南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理審查委員會審批(編號：N20190 709003)，實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動物使用的“3R”原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2主要試劑與儀器 醋酸潑尼松片劑(浙江新琚醫(yī)藥有限公司生產(chǎn),5 mg/片,國藥準(zhǔn)字:H33021207、生產(chǎn)批號：1405172)。注射用鹽酸博萊霉素針劑(日本化藥株式會社生產(chǎn),15 mg/支,國藥準(zhǔn)字:H20090885、生產(chǎn)批號：740422)。NaHS(sodium hydrosulfide)購自美國Sigma公司。兔抗鼠TGF-β1單克隆抗體和兔抗鼠α-SMA體多克隆抗體分別購自美國assaybiotech和美國宜康有限公司；鼠抗人E-cad 單克隆和鼠抗人VIM多克隆抗體均購自美國Epitomics公司。DAB顯色劑購自江蘇艾佳生物技術(shù)有限；RNA提取試劑盒及cDNA合成試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。主要儀器有：光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；連續(xù)光譜酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；核酸蛋白檢測儀、超速冷凍離心機(jī)(德國EPPendorf公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組 將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)均分為4組：對照組、博來霉素組、NaHS+博來霉素組、潑尼松+博來霉素組。博來霉素組、NaHS+博來霉素組、潑尼松+博來霉素組氣管內(nèi)灌注 BLM 溶液5 mg/kg建立肺纖維化模型。從造模后第1天開始，NaHS+博來霉素組予NaHS 溶液28 μmol/(kg·d)腹腔注射，潑尼松+博來霉素組予醋酸潑尼松0.56 mg/(kg·d)經(jīng)胃管灌入，對照組和博來霉素組注射等體積生理鹽水。于造模后第7、14、28 d隨機(jī)處死各組大鼠5只，將大鼠左肺組織4%甲醛固定后行HE 和 Masson染色，HE和Masson染色光學(xué)顯微鏡觀察各組肺泡炎和肺纖維化情況，根據(jù)Szapiel et al[4]報道的評分方法對各組HE切片行肺泡炎及肺纖維化程度判斷 ；免疫組化法測定各組肺組織中TGF-β1、E-Cad、VIM及α-SMA蛋白表達(dá)水平。取大鼠右肺組織置于-196 ℃液氮保存，RT-PCR法測定各組肺組織中TGF-β1、E-Cad、VIM及α-SMA的mRNA表達(dá)水平。

1.2.2免疫組化方法(SP法)測定各組大鼠肺組織各指標(biāo)蛋白表達(dá) 肺組織石蠟切片，采用SP法按試劑盒要求依次滴加相應(yīng)濃度抗體，然后對切片依次行顯色、脫水、透明、封固、鏡檢，陰性對照中采用PBS替代一抗行相同操作，測定各組TGF-β1、E-Cad、VIM、α-SMA蛋白表達(dá)。

1.2.3RT-PCR法測定肺組織中各指標(biāo)mRNA的表達(dá) 依照試劑盒要求提取總RNA并合成cDNA，按相應(yīng)條件加入各指標(biāo)引物并擴(kuò)增：其中TGF-β1序列F：5′-GAACCAAGGAGACGGAATACAG-3′及R：5′-AACCCAGGTCCTTCCTAAAGTC-3′，退火溫度56 ℃，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為299 bp；E-cad序列F：5′-AGGG TCTGAGAAGACAGAAACG-3′及R：5′-GGATAAACT CTGGCCTGTTGTC-3′，退火溫度57 ℃，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為351 bp；VIM序列F：5′-AGGCAAAGCAGGAGTCAAAC-3′及R：5′-TCTTCCATTTCACGCATCTG-3′，退火溫度57 ℃，增產(chǎn)物長度為115 bp；α-SMA 序列 F：5′-TTCCTTCGTGACTACTGCTGAG-3′及R：5′-CA ATGAAAGATGGCTGGAAGAG-3′，退火溫度55 ℃，擴(kuò)增長度為209 bp；β-actin序列F：5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′及R：5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′，退火溫度50 ℃，擴(kuò)增長度為432 bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl經(jīng)1.5%的瓊脂凝膠電泳，測定擴(kuò)增條帶的吸光光度值并計(jì)算mRNA的含量表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 HE和Masson染色光學(xué)顯微鏡觀察對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，HE染色未見明顯炎性細(xì)胞滲出及出血，Masson染色表現(xiàn)為細(xì)支氣管壁旁及肺泡間隔內(nèi)少量膠原纖維沉著。博來霉素組于造模后第7天、14天、28天均出現(xiàn)不同程度肺組織結(jié)構(gòu)破壞、肺泡腔萎陷變窄、塌陷融合甚至消失、肺泡間隔增寬改變、細(xì)支氣管壁旁及肺泡間隔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞增生及藍(lán)綠色膠原纖維沉積等改變，以造模后第28天時最明顯。與博來霉素組對應(yīng)時間點(diǎn)相比，NaHS+博來霉素組、潑尼松+博來霉素組大鼠肺組織在肺泡結(jié)構(gòu)改變、炎癥細(xì)胞浸潤及膠原纖維沉積等各方面均有不同程度減輕，且NaHS+博來霉素組減輕程度高于潑尼松+博來霉素組。見圖1、2。

圖1 各組肺組織第28天HE ×400A：對照組；B：博來霉素組 ；C：NaHS+博來霉素組；D：潑尼松+博來霉素組

圖2 各組肺組織第28天Masson染色 ×400A：對照組；B：博來霉素組；C：NaHS+博來霉素組；D：潑尼松+博來霉素組

2.2 肺泡炎及肺纖維化程度判斷對各組肺組織HE染色切片進(jìn)行肺纖維化程度半定量評分，比較造模后第7、14、28天各組肺組織肺泡炎及肺纖維化程度，結(jié)果顯示各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=286.91、206.160、357.53，P<0.05)。其中博來霉素組、NaHS+博來霉素組、潑尼松+博來霉素組各時間點(diǎn)肺纖維化程度較對照組有不同程度增強(qiáng)(均P<0.05)，以博來霉素組造模后第28天降低最多；NaHS+博來霉素組、潑尼松+博來霉素組各時間點(diǎn)肺纖維化程度低于博來霉素組(均P<0.05)，以NaHS+博來霉素組造模后第28天降低最多。見表1。

表1 肺泡炎及肺纖維化程度分級積分

2.3 各組肺組織E-cad蛋白及mRNA表達(dá)變化比較造模后第7、14、28天各組肺組織E-cad蛋白及mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.833、37.407、100.76，P<0.05；F=214.179、271.22、266.200，P<0.05)。其中博來霉素組、NaHS+博來霉素組、潑尼松+博來霉素組E-cad蛋白和mRNA含量在各時間點(diǎn)較對照組均有下降(均P<0.05)，其中 博來霉素組于造模后第28天時下降最多；但NaHS+博來霉素組、潑尼松+博來霉素組E-cad蛋白和mRNA含量在各時間點(diǎn)較博來霉素組有升高(P<0.05)，其中以NaHS+博來霉素組造模后第28天升高最多。見圖3、4和表2。

圖3 各組肺組織第28天E-cad免疫組化 ×400A：對照組；B：博來霉素組；C：NaHS+博來霉素組；D：潑尼松+博來霉素組

圖4 各組肺組織 E-cad、TGF-β1、VIM、α-SMA的mRNA表達(dá)A：對照組；B：博來霉素組；C：NaHS+博來霉素組；D：潑尼松+博來霉素組；M：DNA Marker

表2 各組大鼠肺組織 E-cad的mRNA和蛋白表達(dá)

2.4 各組大鼠肺組織TGF-β1 、VIM、α-SMA蛋白及mRNA的表達(dá)變化比較造模后第7、14、28天各組肺組織TGF-β1、VIM、α-SMA蛋白和mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 40.278、61.868、71.004，F(xiàn)=60.795、75.407、62.672，P<0.05；F=512.057、864.781、909.960，F(xiàn)=52.301、66.503、48.344，P<0.05；F=387.370、347.623、1 708.940，F(xiàn)=226.534、219.513、778.064，P<0.05)。其中博來霉素組、NaHS+博來霉素組、潑尼松+博來霉素組TGF-β1、VIM、α-SMA蛋白和mRNA含量在各時間點(diǎn)較對照組有升高(均P<0.05)，以博來霉素組造模后第28天升高最多；NaHS+博來霉素組、潑尼松+博來霉素組TGF-β1、VIM、α-SMA蛋白和mRNA含量在各時間點(diǎn)較博來霉素組有降低(均P<0.05)，以NaHS+博來霉素組造模后第28天降低最多。見圖5～7和表3～5。

表3 各組大鼠肺組織 TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠肺組織VIM的mRNA和蛋白表達(dá)

表5 各組大鼠肺組織α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)

圖5 各組肺組織第28天TGF-β1免疫組化 ×400A：對照組；B：博來霉素組；C：NaHS+博來霉素組；D：潑尼松+博來霉素組

圖6 各組肺組織第28天VIM免疫組化 ×400A：對照組；B：博來霉素組；C：NaHS+博來霉素組；D：潑尼松+博來霉素組

圖7 各組肺組織第28天α-SMA免疫組化 ×400A：正常組；B：博來霉素組 ；C：NaHS+博來霉素組；D：潑尼松+博來霉素組

3 討論

H2S是近年來被廣泛關(guān)注的一種新型氣體信號分子，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗增殖、抗凋亡、調(diào)節(jié)血管張力、修復(fù)血管損傷等生物學(xué)作用，在肺、肝、腎、心臟等多種疾病中發(fā)揮重要作用[5]。哺乳動物體內(nèi)內(nèi)源性H2S主要是以體內(nèi)半胱氨酸為底物，由胱硫醚γ裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)和半胱氨酸在磷酸吡多醛-5′-磷酸-依賴性酶胱硫醚β合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)催化形成，而外源性H2S主要可以NaHS為供體,其進(jìn)入體內(nèi)后可解釋離為Na+和HS-，后者與體內(nèi)H+結(jié)合生成H2S。Tan et al[6]已在多種纖維化動物模型中發(fā)現(xiàn)血漿H2S水平有降低，外源性補(bǔ)充H2S可部分逆轉(zhuǎn)纖維化器官的纖維化，因此其被認(rèn)為是潛在抗纖維化治療靶點(diǎn)。Hamelet et al[7]發(fā)現(xiàn)小鼠缺失 5-磷酸吡多醛依賴性酶后，內(nèi)源性 H2S 合成減少，小鼠肺纖維化形成，由此可以推測內(nèi)源性H2S與肺纖維化的病理過程有關(guān)。孫 丹 等[8]通過27例IPF患者和28名健康體檢者對比發(fā)現(xiàn)肺纖維化患者血漿中H2S含量比健康者明顯降低,急性加重時H2S含量明顯高于癥狀緩解時，隨著肺纖維化病變的進(jìn)展，H2S含量無明顯下降，提示H2S 與肺纖維化嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，博來霉素組肺泡炎及肺纖維化程度積分明顯高于正常對照組，提示博來霉素致肺纖維化模型造模成功；NaHS+博來霉素組大鼠的肺泡炎及肺纖維化程度較正常對照組有升高，但較博來霉素組及潑尼松+博來霉素組有減輕，提示H2S可有效降低肺泡炎及肺纖維化程度，進(jìn)一步完善其機(jī)制研究可為肺纖維化的治療提供新策略。

Fang et al[9]研究發(fā)現(xiàn)外源性H2S 通過下調(diào)TGF-β1表達(dá)抑制人類成纖維細(xì)胞(MRC5)遷移、增殖和轉(zhuǎn)型為肌成纖維細(xì)胞，抑制損傷后異常修復(fù)過程，減輕肺纖維化。Gao et al[10]在外源性H2S對肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1及結(jié)締組織生長因子的干預(yù)作用實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，BLM造模后第7、14、28天大鼠肺組織TGF-β1及CTGF蛋白的表達(dá)有明顯升高。給予NaHS處理后各期肺組織TGF-β1及CTGF 蛋白表達(dá)均有顯著下降，進(jìn)一步證實(shí)H2S抗肺纖維化機(jī)制可能與抑制TGF-β1有關(guān)。TGF-β1是促進(jìn)纖維細(xì)胞激活并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的關(guān)鍵作用因子，其功能的發(fā)揮依賴于TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控。TGF-β1/Smads信號通路作為目前公認(rèn)的主要致纖維化通路，除作用于成纖維細(xì)胞外，還是誘導(dǎo)EMT過程的關(guān)鍵途徑[11]。EMT是指上皮細(xì)胞在細(xì)胞因子如TGF-β1等介導(dǎo)下失去其特定的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物如E-Cad，轉(zhuǎn)變?yōu)閾碛虚g質(zhì)標(biāo)記(如α-SMA、N-cadherin)的肌成纖維細(xì)胞并在受損肺泡基底膜處聚集，轉(zhuǎn)變成“成纖維細(xì)胞灶”并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)過量分泌(如Ⅰ型膠原蛋白)和肺纖維化發(fā)生的過程[12]。郭春玉 等[13]已表明EMT與肺纖維化、心包纖維化、腎臟纖維化及類癌纖維相關(guān)等疾病密切相關(guān)，是成纖維化細(xì)胞灶的重要來源之一。Bai et al[14]研究表明外源性H2S可通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad2/3信號通路抑制百草枯誘導(dǎo)的A549細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程減輕肺纖維化。于是課題組推測H2S可通過TGF-β1介導(dǎo)抑制EMT過程，減輕肺纖維化。本實(shí)驗(yàn)通過SP及PCR法測定BLM致大鼠肺纖維化模型中E-cad、TGF-β1、VIM和α-SMA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與對照組相比，博來霉素組從第7天開始TGF-β1及間質(zhì)標(biāo)志物VIM、α-SMA的蛋白和mRNA水平不斷增強(qiáng)，而上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad的蛋白和mRNA水平均出現(xiàn)持續(xù)降低，肺纖維化程度逐漸發(fā)生，提示模型組大鼠肺組織造模成功并出現(xiàn)了EMT改變，由此推測EMT為肺纖維化發(fā)生重要過程，且與TGF-β1密切相關(guān),阻斷該過程有可能會減輕肺纖維化。糖皮質(zhì)激素如潑尼松片是一種傳統(tǒng)抗纖維化藥物,但臨床因副作用大及總體獲益有限等原因已不被臨床推薦，但仍被認(rèn)為對照實(shí)驗(yàn)療效分析常規(guī)藥物。本實(shí)驗(yàn)加入NaHS及潑尼松進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)各時間點(diǎn)NaHS+博來霉素組和潑尼松+博來霉素組TGF-β1、VIM和α-SMA蛋白和mRNA水平較博來霉素組有不同程度降低，而E-cad的蛋白和mRNA水平較博來霉素組有不同程度升高，且均以NaHS+博來霉素組第28天時明顯，提示H2S可能通過降低TGF-β1水平抑制EMT過程減輕肺纖維化。

IPF病死率高且預(yù)后極差，嚴(yán)重危害人類健康，依據(jù)2018年特發(fā)性肺纖維化診斷臨床實(shí)踐指南[15],目前尚無特效治療藥物。近年來吡啡尼酮、尼達(dá)尼布等新型抗纖維化藥物相繼問世，但因其價格昂貴且副作用大、療效不完全確切，臨床尚未廣泛使用。深究H2S/TGF-β1/EMT信號通路，不僅可進(jìn)一步揭示肺纖維化發(fā)生機(jī)制，還可為靶向治療肺纖維化提供新方向。