高秀花，王興麗，劉旭光△，賈 敏，黎海軍

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075;2.山西省針灸研究所，太原 030006)

不同灸法對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎家兔HPAA功能的影響?

高秀花1，王興麗2，劉旭光1△，賈 敏1，黎海軍1

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075;2.山西省針灸研究所，太原 030006)

目的:觀察不同灸法對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)模型的抗炎效應(yīng)，探索其對(duì)實(shí)驗(yàn)性RA下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPAA)功能的影響。方法:采用弗氏完全佐劑法造模，將家兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、直接灸組、隔姜灸組及溫和灸組。于造模前及治療后第7、14、21天測(cè)量各組膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)，用ELISA法檢測(cè)各組血清中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)酮(CS)含量。結(jié)果:各艾灸組膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)明顯低于模型組;其中隔姜灸組下降幅度最大，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;相比模型組，各艾灸組CRF、CS含量明顯降低，ACTH明顯升高;各艾灸組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:不同灸法對(duì)實(shí)驗(yàn)性RA均有明顯的抗炎作用，隔姜灸可能有更好的作用趨勢(shì);不同灸法對(duì)HPAA功能均有明顯的調(diào)整作用，這可能是艾灸抗炎效應(yīng)的重要機(jī)制之一，但不同灸法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

不同灸法;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;下丘腦-垂體-腎上腺軸;CRF;ACTH;CS

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)為主的慢性、全身性自身免疫性難治性疾病，下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(Hypothalamic Pituit Aryadvenal Axis，HPAA)功能紊亂在RA的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)學(xué)“痹癥”范疇，因RA病情頑固、久延難愈且疼痛遍歷周身多個(gè)關(guān)節(jié)，有別于一般的“痹癥”，故又屬于痹癥之“歷節(jié)風(fēng)”、“鶴膝風(fēng)”、“鼓槌風(fēng)”、“頑痹”、“尪痹”等范疇。

大量研究證實(shí)，艾灸治療RA具有確切的抗炎效應(yīng)，HPAA軸作為一條重要的神經(jīng)體液性調(diào)節(jié)途徑在其中發(fā)揮重要作用。艾灸治療RA方法多樣，大體可分為直接灸、溫和灸和隔物灸三大類，溫?zé)岽碳な瞧涔餐?、主要的作用形式，而不同灸法具有不同的溫?zé)岽碳つＪ?，在治療RA中是否存在抗炎效應(yīng)差異，不同灸法對(duì)實(shí)驗(yàn)性RA HPAA功能是否具有不同的影響，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。在前期研究的基礎(chǔ)上，我們從艾灸治療RA的抗炎效應(yīng)出發(fā)，以HPAA為切入點(diǎn)，以“艾灸溫?zé)岽碳?HPAA功能-抗炎效應(yīng)”為研究主線，觀察比較直接灸、隔姜灸、溫和灸治療實(shí)驗(yàn)性RA的抗炎效應(yīng)，探索不同灸法對(duì)實(shí)驗(yàn)性RA家兔HPAA功能的影響，以期更深入地揭示艾灸治療RA的作用原理。

1 材料

1.1 動(dòng)物

日本大耳兔(動(dòng)物及飼料由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)2008-14)40只，雌雄各半，體質(zhì)量(2.5±0.25)kg，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 主要試劑及儀器

弗氏完全佐劑(FCA，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，貨號(hào)Lot071M8715，內(nèi)含0.1%滅活結(jié)核桿菌，購于上海生工公司成都分公司);生理鹽水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)B12021911);艾炷(中國(guó)南陽市東升艾灸廠生產(chǎn)，批號(hào) 120403，艾條規(guī)格: 18mm×200mm，自制成4mm×10mm/壯的艾炷);家兔CRF(Corticotrophin releasing factor促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子)、ACTH(adrenocorticotropic hormone促腎上腺皮質(zhì)激素)、CS(corticosterone皮質(zhì)酮) ELISA試劑盒(購于上海文樂生物科技有限公司，貨號(hào)分別為E71018、E71026、E71031);自動(dòng)平衡離心機(jī)(LD25-2，北京醫(yī)用離心機(jī)廠);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(DG3022，國(guó)營(yíng)華東電子管廠);孵育箱(SN600147-205，USA);洗板機(jī)(4MK2，Japan)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與模型制備

適應(yīng)性馴養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表將家兔分為空白對(duì)照組(簡(jiǎn)稱“空白組”)、RA模型組(簡(jiǎn)稱“模型組”)、溫和灸治療組(簡(jiǎn)稱“溫和灸組”)、直接灸治療組(簡(jiǎn)稱“直接灸組”)、隔姜灸治療組(簡(jiǎn)稱“隔姜灸組”)5組，每組各8只。

選用RA經(jīng)典動(dòng)物模型［1］，馴養(yǎng)1周后，將模型組、各艾灸組家兔雙后膝關(guān)節(jié)周圍剃毛暴露，用10%異丙醇消毒皮膚，輕度彎曲膝關(guān)節(jié)，以膝關(guān)節(jié)髕骨下緣、髕韌帶外側(cè)凹陷為穿刺點(diǎn)，將FCA按0.5 ml/kg體質(zhì)量劑量平均注入兔雙后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi);對(duì)照組家兔同法注入無菌生理鹽水作為對(duì)照。

2.2 治療

于造模后第7天，將各艾灸組家兔分別固定在兔架上，暴露背部及膝關(guān)節(jié)施灸部位(剃毛約2 cm ×2 cm)，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［2］的動(dòng)物穴位圖譜，使用艾炷(4 mm×10 mm)分別直接灸(艾炷底部涂抹少許凡士林固定艾炷)、隔姜灸(姜片厚度約1 mm，大小為2.5 cm×2.5 cm)、溫和灸(距離皮膚約5 mm)家兔“腎俞”、“足三里”穴。每穴連續(xù)施灸5壯，左右交替每日1次，6 d為1個(gè)療程，療程間休息1 d，共治療3個(gè)療程。對(duì)照組和模型組家兔同法抓取、固定，但不予灸。3組同步治療，均在上午9∶00～11∶00之間進(jìn)行。

2.3 膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)測(cè)定

使用軟皮尺過膝關(guān)節(jié)髕骨下緣、髕韌帶外側(cè)凹陷的穿刺點(diǎn)，于造模前及治療第7、14、21天分別測(cè)定各組家兔左右后肢的膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)。

2.4 取樣

治療第21天上午9∶00～11∶00間，經(jīng)耳緣靜脈取血5 ml并注射空氣處死各組家兔，于離心管內(nèi)靜置1 h，經(jīng)離心后取上清液放入Eppendorf管，用記號(hào)筆標(biāo)號(hào)，-20℃冰箱保存待測(cè)。按照試劑盒說明書操作，用 ELISA雙抗夾心法檢測(cè)血清中 CRF、ACTH、CS含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，組間比較用單因素方差分析，方差齊時(shí)選用LSD(Least Significant Differece，最小顯著差異法)，方差不齊時(shí)選用Tamhane’s T2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 不同灸法對(duì)實(shí)驗(yàn)性RA家兔膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)的影響

表1、2顯示，造模前各組家兔左、右膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與空白組比較，造模后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型組家兔左、右膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)均顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，治療第7、14、21天各艾灸組家兔左、右膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)均明顯降低(P＜0.01);3個(gè)治療組之間比較，在治療第14、21天隔姜灸組左、右膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)下降幅度較大，但與溫和灸組、直接灸組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組家兔左膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)比較(±s)

表1 各組家兔左膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)比較(±s)

注:與空白組比較:△△P＜0.01;與模型組比較:＊＊P＜0.01

組別 家兔數(shù) 造模前(cm) 治療后第7天(cm) 治療后第14天(cm) 治療后第21天(cm)空 白 組 8 10.68±0.30 10.83±0.21 10.75±0.27 10.70±0.28模 型 組 8 10.57±0.22 12.66±0.31△△ 12.37±0.42△△ 12.02±0.34△△溫 和 灸 組 8 10.72±0.35 12.13±0.29＊＊ 11.83±0.3＊＊ 11.31±0.21＊＊直 接 灸 組 8 10.61±0.30 12.16±0.21＊＊ 11.72±0.27＊＊ 11.39±0.21＊＊隔 姜 灸 組 8 10.66±0.30 12.16±0.14＊＊ 11.71±0.37＊＊ 11.19±0.40＊＊

4.2 不同灸法對(duì)實(shí)驗(yàn)性RA家兔HPAA功能的影響

表3顯示，與空白組比較，模型組CRF、CS含量顯著升高(P＜0.01)，ACTH含量顯著降低(P＜ 0.01);與模型組比較，溫和灸組、直接灸組和隔姜灸組CRF、CS含量均顯著降低(P＜0.01)，ACTH含量均顯著升高(P＜0.01);3個(gè)治療組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組家兔右膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)比較(±s)

表2 各組家兔右膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)比較(±s)

注:與空白組比較:△△P＜0.01;與模型組比較:＊＊P＜0.01

組別 家兔數(shù) 造模前(cm) 治療后第7天(cm) 治療后第14天(cm) 治療后第21天(cm)空 白 組 8 10.74±0.24 10.82±0.16 10.78±0.20 10.65±0.31模 型 組 8 10.56±0.24 12.63±0.36△△ 12.39±0.40△△ 12.04±0.18△△溫 和 灸 組 8 10.70±0.35 12.13±0.30＊＊ 11.83±0.32＊＊ 11.38±0.17＊＊直 接 灸 組 8 10.61±0.30 12.10±0.20＊＊ 11.80±0.22＊＊ 11.32±0.39＊＊隔 姜 灸 組 8 10.73±0.35 12.14±0.15＊＊ 11.73±0.22＊＊ 11.19±0.48＊＊

表3 各組家兔血清中CRF、ACTH、CS含量比較(±s)

表3 各組家兔血清中CRF、ACTH、CS含量比較(±s)

注:與空白對(duì)照組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:△△P＜0.01

組別 家兔數(shù)(只) CRF(pg/ml) ACTH(pg/ml) CS(pg/ml)空 白 組813.23± 2.92 248.95±49.89 42.39± 0.79模 型 組 8 195.88±22.37＊＊ 45.66± 9.69＊＊ 172.21±28.80＊＊溫 和 灸 組 8 112.37±24.28△△ 180.15±39.57△△ 68.95±17.79△△直 接 灸 組 8 127.84±40.42△△ 173.78±53.81△△ 70.37±23.94△△隔 姜 灸 組 8 100.67±35.47△△ 142.18±38.19△△ 70.34±12.56△△

5 討論

RA是以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確［3］，滑膜炎癥反應(yīng)是RA的主要病理變化，主要癥狀為局部的紅、腫、熱、痛。因此，本實(shí)驗(yàn)從宏觀角度選擇測(cè)量家兔的膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)以判斷炎癥反應(yīng)的程度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果本研究造模成功，模型組炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，3種灸法均有明顯的抗炎、消腫作用，雖3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但隔姜灸可能有更好的作用趨勢(shì)，與文獻(xiàn)報(bào)道相近［4］。

近年來，隨著神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)的進(jìn)展，HPAA在RA發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到重視［5］。HPAA功能紊亂，機(jī)體內(nèi)分泌-神經(jīng)-免疫系統(tǒng)將發(fā)生異常。HPAA主要的調(diào)節(jié)物質(zhì)分別是由腎上腺、垂體、下丘腦分泌的GC(glucocorticoid糖皮質(zhì)激素)、ACTH、CRH(corticotropin releasing hormone促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素)組成。GC是體內(nèi)首要的抗炎物質(zhì)，與ACTH、CRH三者間互相影響，通過復(fù)雜的正、負(fù)反饋調(diào)節(jié)構(gòu)成完整的HPAA［6］。因此，調(diào)整HPAA功能，糾正其紊亂狀態(tài)，最終實(shí)現(xiàn)控制RA的炎癥反應(yīng)，將成為治療RA的新的有效方法。

RA屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，其主要病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，中醫(yī)治療RA多從腎論治［7］?！鹅`樞·官能》中的“針?biāo)粸椋闹恕备叨仍u(píng)價(jià)了灸法這一傳統(tǒng)療法，灸法可補(bǔ)針?biāo)幹蛔?，善于溫?jīng)通絡(luò)、散寒止痛、行氣活血、扶陽固脫、補(bǔ)腎固本、升陽舉陷等［8］，尤其在虛、寒類疾病治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，合以“腎俞”、“足三里”兩穴，共奏溫腎健脾、補(bǔ)益氣血治本、活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)治標(biāo)之效。

已有相關(guān)研究［9-10］證實(shí)，艾灸治療RA能夠通過有效調(diào)整HPAA功能來發(fā)揮確切的抗炎效應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)觀察具有不同溫?zé)岽碳つＪ降牟煌姆▽?duì)實(shí)驗(yàn)性RA HPAA功能是否具有不同的影響。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組血清CRF、CS含量顯著高于空白組，ACTH含量則顯著降低，提示RA模型中存在HPAA功能紊亂;治療后各艾灸組CRF、 CS含量明顯低于模型組，ACTH含量則明顯升高，提示不同灸法治療實(shí)驗(yàn)性 RA均可能通過調(diào)整HPAA功能，從而發(fā)揮明顯的抗炎效應(yīng);各艾灸組間CRF、ACTH、CS含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示不同灸法對(duì)實(shí)驗(yàn)性RA HPAA功能的調(diào)整作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上我們認(rèn)為，不同灸法治療實(shí)驗(yàn)性RA均有明顯的抗炎效應(yīng)，隔姜灸可能有更好的作用趨勢(shì);不同灸法對(duì)實(shí)驗(yàn)性RA HPAA功能均有明顯的調(diào)整作用，這可能是艾灸發(fā)揮抗炎效應(yīng)的重要機(jī)制之一。雖然本研究發(fā)現(xiàn)不同灸法對(duì)實(shí)驗(yàn)性 RA家兔的HPAA功能調(diào)整作用無明顯差異，但不排除不同灸法可能會(huì)不同程度地誘導(dǎo)熱休克蛋白(HSP)等相關(guān)分子表達(dá)，從而發(fā)揮不同的治療作用，故需要在今后的研究中進(jìn)一步探索。

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Effects of Different Moxibustion on the Function of HPAA in Rabbits with Rheumatoid Arthritis

GAO Xiu-hua1，WANG Xing-li2，LIU Xu-guang1△，JIA Min1，LI Hai-jun1
(1．Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，China;2．Shanxi Institute of acupuncture，Taiyuan 030006，China)

Objective:To observe the anti-inflammatory effect of different moxibustion on rheumatoid arthritis(RA) models，to explore their effects on the hypothalamus-pituitary-adrenal cortical axis(HPAA)function.Method:The RA animal model was established by Freund′s complete adjuvant method.Japanese rabbits were randomized to blank-control group，RA model group，direct moxibustion group，ginger moxibustion group or mild moxibustion group.Before model building and on the 7th，14th，21st day after treatment，to measure each rabbit back-knee circumference by a tape measure，to detect the content of ACTH，CRF and CS in the rabbit serum by ELISA.Results:(1)Compared with the model group，all moxibustion treatments could remarkably decrease the knee circumference，the circumference’s decline magnitude of the ginger moxibustion group is largest among them，but there are no statistical significance.(2)Compared with the model group，all moxibustion treatments could remarkably decrease CRF、CS content and increase ACTH content，but their content have no significant difference among three moxibustion groups.Conclusion:All moxibustion treatments have significant anti-inflammatory effects on RA models，ginger moxibustion may have a better trend of effect among them; All moxibustion treatments can adjust HPAA functions obviously.So，adjusting HPAA functions may be one of the important mechanisms of moxibustion’s anti-inflammatory effect，however，there are no significant difference in the expression of HPAA in different moxibustion methods.

Different Moxibustion;RA;HPAA;CRF;ACTH;CS

R593.22

:A

:1006-3250(2015)09-1140-03

2015-03-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173319)-不同灸法治療RA的抗炎效應(yīng)及其HSP70分子調(diào)控機(jī)制研究

高秀花(1989-)，女，山西忻州人，醫(yī)學(xué)碩士，從事針灸治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:劉旭光(1965-)，男，四川資中人，研究員，博士研究生導(dǎo)師，從事針灸調(diào)整神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫疾病的基礎(chǔ)研究，Tel:13208181517，E-mail:lxg418@126.com。