邵毅，余瑤，裴重剛，胡佩宏，楊璐，黃歆，涂萍

（1.南昌大學第一附屬醫(yī)院 眼科，江西 南昌330006；2.南方醫(yī)科大學附屬南昌第三醫(yī)院 內分泌科，江西 南昌330009）

術后結膜傷口愈合不良是青光眼濾過術晚期失敗的主要原因[1]。有些疤痕體質的患者，盡管使用高濃度的5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）或絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）仍可能導致晚期濾過泡形成失敗[2]。青光眼濾過術后的傷口瘢痕問題，已成為眼科的熱點和難點，因此，尋找安全、有效、副作用小的抗瘢痕藥物極為關鍵[3]。吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是一種新型抗纖維化藥物，動物模型和臨床試驗已證明其具有抗纖維化的潛力[4]。PFD能下調轉化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）及結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）[5]，也可以清除活性氧，從而抑制組織修復[6]。在人視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞，PFD可以阻止TGF-β1誘導的纖連蛋白合成[7]。此外，PFD能抑制白介素-1誘導的金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metallopro teinases 1，TIMP1），增加甲狀腺相關眼病患者眼眶成纖維細胞的抗纖維化作用[8]。而本研究旨在探討PFD在兔小梁切除術后抑制結膜濾過泡瘢痕化的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 PFD滴眼液的制備

將PFD粉末（P2116，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）溶解于無菌水中，配成濃度約5mg/ml（0.5%）的溶液，保存于4℃冰箱內，有效時間為24 h。

1.2 手術方法和分組

26只新西蘭白兔，體重2.0～2.5 kg，雌雄不限，檢查無眼部疾患及全身器質性疾病。2只作為陰性對照組。所有實驗操作過程和方法均遵循ARVO委員會規(guī)定的眼科和視覺科學相關的動物使用原則，符合動物倫理委員會標準，并經(jīng)南昌大學第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會許可。兔子飼養(yǎng)在18～25℃標準的恒溫動物箱內，12 h光照/黑暗周期，同時給予標準的食物和水進行喂養(yǎng)。24只兔子（24只眼，均為右眼）隨機分為兩組：所有兔經(jīng)腹膜內注射戊巴比妥鈉（50mg/kg）和局部用0.5%的鹽酸丙美卡因表面麻醉，0.5%碘伏消毒。鋪巾開瞼，剪去第3眼瞼，置上、下、內、外直肌牽引線，固定眼球，在顯微鏡手術條件下，于右眼上象限鞏膜區(qū)進行常規(guī)小梁切除術。約1/2厚的梯形鞏膜瓣，大小約4mm×3mm×3mm，切除約1.5mm×3.0mm的小梁組織和部分虹膜組織，用10-0尼龍線縫合鞏膜瓣和結膜瓣，手術結束時結膜下注射地塞米松1ml。A組給予0.5%（5mg/ml）PFD滴眼液滴眼，B組給予磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）滴眼，連續(xù)使用28 d。所有手術均在手術顯微鏡（VISU150，卡爾蔡司，德國）下進行，并由同一熟練操作者完成，術后涂紅霉素眼藥膏。此外，術后1周用諾氟沙星滴眼液點手術眼，3次/d。隨訪至術后28 d。用0.5%鹽酸丙美卡因麻醉后，用Tonocon眼壓計記錄兔雙眼眼壓。手術后1、7、14、21和28 d分別觀察兔眼濾過泡及并發(fā)癥，共聚焦顯微鏡檢查兔眼濾過泡情況，同時使用實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）對比觀察手術區(qū)的組織變化。

1.3 共聚焦顯微鏡檢查

采用Confoscan 4裂隙掃描共聚焦顯微鏡（Nidek Co.LTD，日本）檢查。操作步驟[9]：待檢兔眼表面麻醉后，將兔頭部固定顯微鏡前，雙眼固視正前方，檢查者移動鏡頭使共焦顯微鏡與結膜上皮細胞接觸時，將鏡頭緩慢向前推進，于結膜濾過泡區(qū)進行全層掃描，結束后選擇有價值的圖像和錄像存盤，并計算平均微囊密度及平均微囊面積[10]。

1.4 實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應

手術后7、14、21、28和56 d，取濾過泡區(qū)的組織（包括結膜、筋膜和鞏膜）進行CTGF的RT-PCR[3]。每個時間點得到的組織在1m l提取試劑（Trizol試劑，武漢生命技術有限公司，中國）中勻漿，用cDNA合成試劑盒（Toyobo，日本）合成cDNA。在實時PCR檢測系統(tǒng)（SLAN紅石醫(yī)藥科技有限公司，中國），使用SYBR預混的Taq試劑盒進行實時PCR測定。通過比較閾值循環(huán)方法進行結果分析，并通過管家基因β-actin進行標準化。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用Graph Pad Prism 4.00統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（±s）表示，比較兩組眼壓差異、結膜囊泡密度和面積等用單因素方差分析Studentt檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 濾過泡情況

A組術后第7天可見有輕微的結膜充血和良好的濾過泡存在，術后14 d，結膜稍充血，濾過泡形成良好，觀察28 d后沒有明顯的炎癥反應，濾過泡仍隆起、彌散；B組術后第7天可見結膜充血和良好的濾過泡，術后14 d，結膜充血減輕，濾過泡平坦，瘢痕形成，觀察28 d后大部分濾過泡瘢痕化。術后1、7和14 d兩組的濾過泡評分比較，差異均無統(tǒng)計學意義（t1d=0.326，t7d=0.652，t14d=0.959，均P>0.05）；術后21和28 d兩組的濾過泡評分比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t21d=9.142，t28d=15.741，均P<0.05）（見表1）。觀察兩組無一例眼內炎、前房出血和白內障發(fā)生，少數(shù)出現(xiàn)傷口一過性的周圍角膜水腫。

2.2眼壓

手術前和手術后1、7、14、21和28 d的早上8～9點測定眼壓。在術前每組眼壓與正常對照組比較，均有明顯降低（tA=6.732，tB=6.837，均P<0.05）。術后早期眼壓明顯降低，但隨時間延長逐漸升高。術前及術后1和7 d，兩組眼壓比較，差異均無統(tǒng)計學意義（t術前=0.352，t1d=0.647，t7d=0.753，均P>0.05）；術后14、21和28 d，兩組眼壓比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t14d=3.463，t21d=4.056，t28d=5.194，均P<0.05）。見表2。

2.3 共聚焦顯微鏡結果

正常結膜上皮基底細胞顯示為光暗的細胞體，細胞邊界窄（見圖1A）。經(jīng)過0.5%PFD滴眼液處理28 d的A組在結膜濾過泡區(qū)上皮及基質層出現(xiàn)了許多大小不一的微囊泡，周邊可見部分呈亮光樣炎癥細胞包繞（見圖1B）；而經(jīng)過PBS處理的B組在結膜濾過泡區(qū)上皮及基質層可見少許的小微囊泡及少量的亮光樣炎癥細胞（見圖1C）。通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過治療28 d后，A組結膜上皮下平均微囊密度和平均微囊面積分別為（112±22）個/mm2和（28 589±14 268）μm2，而B組結膜上皮下平均微囊密度和平均微囊面積分別為（26±19）個/mm2和（4 989±2 329）μm2，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（tmd=16.842，tma=14.894，均P<0.05，見圖1D，1E）。

2.4 mRNA檢測

A組術后各時間點在濾過泡區(qū)CTGFmRNA表達明顯下調，而B組CTGF在濾過泡區(qū)CTGF mRNA未見明顯改變，兩組在各時間點比較差異有統(tǒng)計學意義（t7d=2.476，t14d=4.892，t21d=7.638，t28d=9.452，均P<0.05），見圖2。

表1 實驗動物術前和術后各時段兔結膜濾過泡評分比較 （n=12，±s）

表1 實驗動物術前和術后各時段兔結膜濾過泡評分比較 （n=12，±s）

組別 術前 術后1 d 術后7 d 術后14 d 術后21 d 術后28 d A-3.26±0.14 3.72±0.46 3.66±0.65 4.32±0.64 4.17±0.73 3.36±0.25 3.66±0.38 3.23±0.29 3.18±0.43 2.51±0.37 t值 - 0.326 0.652 0.959 9.142 15.741 P值 - 0.973 0.652 0.326 0.048 0.025 B -

表2 實驗動物術前和術后各時段眼壓比較 （n=12，mmHg，±s）

表2 實驗動物術前和術后各時段眼壓比較 （n=12，mmHg，±s）

組別 術前 術后1 d 術后7 d 術后14 d 術后21 d 術后28 d A 16.24±0.26 12.81±0.38 13.26±0.41 13.45±0.36 13.84±0.43 14.15±0.51 17.46±0.22 12.52±0.42 13.52±0.47 14.57±0.52 16.22±0.58 17.28±0.62 t值 0.352 0.647 0.753 3.463 4.056 5.194 P值 0.982 0.864 0.745 0.044 0.028 0.016 B

圖1 兩組術后28 d兔結膜濾過泡的共焦顯微鏡圖像

圖2 兩組兔結膜手術區(qū)CTGF mRNA表達

3 討論

青光眼是導致不可逆性盲的主要原因，是僅次于白內障導致失明的第2大常見原因，發(fā)病率約為0.21%～1.64%[11]。目前，濾過性手術仍是青光眼的主要治療手段，但鞏膜表層、Tenon囊和球結膜之間成纖維細胞增生、膠原合成增加等，使濾過道瘢痕化而影響其濾過功能[12]，導致手術失敗。為了抑制瘢痕形成，防止濾過道瘢痕化，目前術中常用的抗代謝藥物如5-FU和MMC均可以防止術后瘢痕形成，但常常會導致結膜泡漏、低眼壓、鞏膜溶解、眼內炎等并發(fā)癥[13]。此外，研究者發(fā)現(xiàn)皮質類固醇可以減少濾過道纖維細胞增生。尹寶存[14]采用濾過性手術聯(lián)合局部點用皮質類固醇藥物治療急性閉角型青光眼急性發(fā)作及慢性閉角型青光眼，有效地解決了術后炎癥和傷口愈合過程中纖維組織增生、濾過道瘢痕化的難題。但其在低濃度時不僅不能抑制成纖維細胞增殖，反而能起到促進作用，局部低濃度滴藥造成濾過道的纖維化，而結膜下注射易形成無功能濾過泡，且長期應用并發(fā)癥多。

術后濾過道瘢痕化是青光眼濾過手術后期失敗的主要原因，是眼壓長期有效控制和視神經(jīng)損害保護的一個重大障礙。近年來，抗濾過道瘢痕化藥物作用被越來越多的人肯定，手術聯(lián)合各類抗瘢痕藥物的優(yōu)勢也逐漸凸顯，在拓寬了手術適應范圍的同時，也保證了手術的成功率，增加了青光眼患者復明的希望。PFD在體外的很多細胞（例如肝星狀細胞、腎成纖維細胞、子宮肌層細胞及肌瘤細胞）和許多器官（例如腎、肺和肝臟）有抗炎和抗纖維化的作用。目前，PFD在若干臨床試驗中得到了應用，包括肥厚性心肌病、肺纖維化、神經(jīng)纖維瘤、子宮平滑肌瘤、特發(fā)性硬皮病、硬化性腹膜炎和輻射誘發(fā)的纖維化等。雖然PFD在眼部的抗纖維化機制仍不清楚，但有研究表明，PFD能下調人眼球筋膜成纖維細胞TGF-β1的mRNA的表達，對其增殖、遷移及其在體外的膠原收縮具有明顯的抑制作用。前期已經(jīng)研究了青光眼與全身疾病如阿爾默海茨病[15]、帕金森病[16]等的關系，以及一部分抗瘢痕的物質如紅花保存羊膜[3]、晶狀體前囊膜等[17]在青光眼的應用，目前的初步研究結果發(fā)現(xiàn)PFD能調節(jié)青光眼小梁切除手術區(qū)的鞏膜瓣和結膜組織CTGF mRNA的表達，且濾過泡形成良好，有明顯的抗瘢痕作用。

總之，本文通過實驗對照，發(fā)現(xiàn)PFD滴眼液在兔小梁切除術后能減少術后結膜鞏膜間的瘢痕愈合。其原因可能是青光眼小梁切除術后濾過泡容易粘連而產(chǎn)生瘢痕化，而PFD滴眼液能有效抗瘢痕，保持濾過道通暢，所以濾過泡存活得更為持久。隨著細胞生物學、分子生物學、組織工程學的建立及學科間的交叉發(fā)展，闡明青光眼濾過道愈合的過程，進一步研究現(xiàn)有抗纖維化藥物抗瘢痕化的作用機制，尋找療效好、毒副作用小、來源豐富的成分，仍是青光眼術后抗瘢痕化的研究方向。目前，大多數(shù)研究還處于體外和動物實驗階段，尚有待于進一步明確PFD對青光眼濾過道瘢痕化作用的相關機制和細胞信號通道，這將為臨床隨機對照試驗的研究奠定可靠的基礎。

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