龍璐，王堃，陳貞，朱樂(lè)攀，易斌

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖南 長(zhǎng)沙410008）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國(guó)南部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于其早期病灶小，癥狀不典型，易忽略及誤診[1]，具有惡性程度高及易發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，病死率很高，嚴(yán)重威脅人們的身體健康和生命安全。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤致死的根本原因。因此，篩選NPC轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白（基因），早期判斷NPC的轉(zhuǎn)移是降低死亡率的關(guān)鍵所在。

本課題組前期采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，三結(jié)構(gòu)域包含蛋白29（tripartite motif-containing protein 29，TRIM 29）、死骨片蛋白-1（sequestosome-1，SQSTM 1）、根蛋白（radixin，RDX）在高轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞5-8F中和低轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞6-10B中均表達(dá)上調(diào)。大量研究證實(shí)[2-5]，這3個(gè)基因與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但其在鼻咽癌研究中尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文采用5-8F和6-10B兩株不同轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌細(xì)胞系，檢測(cè)其TRIM 29、SQSTM 1、RDX基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平，并在該基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究TRIM 29對(duì)5-8F細(xì)胞增殖及遷移能力的影響，為以后深入研究其與NPC轉(zhuǎn)移的關(guān)系提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 高轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞系5-8F和低轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞系6-10B，由衛(wèi)生部腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑 小牛血清和流式單染試劑碘化丙錠（PI）購(gòu)自Gibco公司，RPMI 1640購(gòu)自Hyclone公司，脂質(zhì)體2000和G418購(gòu)自Invitrogen公司，PVDF膜和Luminata Crescendo Western HRP Substrate發(fā)光液購(gòu)自Millipore公司，四甲基噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Sigma公司，鼠抗人SQSTM 1抗體和鼠抗人TRIM 29抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，兔抗人RDX抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Abcam公司，鼠抗人β-actin抗體購(gòu)自Auragene公司，TRIM 29、SQSTM 1、RDX基因及內(nèi)參GAPDH引物均由上海吉?jiǎng)P公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 5-8F細(xì)胞和6-10B細(xì)胞用含12%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 qRT-PCR 檢測(cè)TRIM 29、SQSTM 1、RDX基因的mRNA 表達(dá)水平 TRIM 29上游引物5'-T GCGAGCTGCATCTCAAGC-3'，下游引物5'-GGTGC TATGATTCTTGTGCTCC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為189 bp；SQSTM 1上游引物5'-GACTACGACTTGTGTAGCGT C-3'，下游引物5'-AGTGTCCGTGTTTCACCTTCC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為139 bp；RDX上游引物5'-GAGATGAAACCAAGAAAACAC-3'，下游引物5'-CTCACAT TGCTTCAAACTCA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為138 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物5'-TGACTTCAACAGCGACACC CA-3'，下游引物5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為121 bp。反應(yīng)條件：95℃3min，95℃30 s，53℃20 s，72℃30 s，47個(gè)循環(huán)。

1.2.3 Western blot 檢 測(cè)TRIM 29、SQSTM 1、RDX 蛋白表達(dá)水平 上樣量30μg。10%SDS-PAGE電泳，60 V電泳40min，待樣品進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)至120 V繼續(xù)電泳約90min，100 V轉(zhuǎn)膜60min，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗（TRIM 29 1︰200、SQSTM1 1︰100、RDX1︰2 500、β-actin 1︰2 500）4℃孵育過(guò)夜，二抗1︰12 000孵育90min，加適量發(fā)光液，用Chem-iDocTMXRS+System with Image LabTMSoftware進(jìn)行自動(dòng)發(fā)光成像。

1.2.4 s iR NA 的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI GenBank中TRIM 29基因（NM_012101）信息，按照siRNA干擾片段設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)siRNA序列，由上海吉?jiǎng)P公司合成。上游引物：5'-GATCCCCCATCGCTATGTGAAC AACTACTCGAGTAGTTGTTCACATAGCGATGGTTT TTGGAT-3'，下游引物：5'-AGCTATCCAAAAACCAT CGCTATGTGAACAACTACTCGAGTAGTTGTTCACA TAGCGATGGGG-3'；空白質(zhì)粒表達(dá)載體序列：TTCT CCGAACGTGTCACGT。BLAST序列分析證明所設(shè)計(jì)的序列與人其他編碼序列無(wú)同源性。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染、分組及篩選陽(yáng)性細(xì)胞 設(shè)對(duì)照組（只加脂質(zhì)體）、空白質(zhì)粒對(duì)照組及TRIM 29特異性siRNA組。轉(zhuǎn)染步驟按脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染結(jié)束后挑取克隆，Western blot驗(yàn)證是否為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.6 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將各組細(xì)胞以2 000個(gè)/孔的濃度接種于96孔板，MTT檢測(cè)7 d。490 nm處測(cè)定各孔吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 收集各組細(xì)胞1瓶，PBS洗滌3次，用預(yù)冷的70%乙醇充分混勻細(xì)胞，4℃固定24 h，制成細(xì)胞懸液，與Tris-HCl緩沖液（含20μg/ml RNA酶）混勻，37℃孵育30min，加50μg/m l碘化丙錠（PI）染液染色細(xì)胞DNA。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外遷移能力 5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右匯合時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用200μl的Tip頭在皿底畫(huà)4條平行線，PBS清洗3遍，加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，于0、24和48 h倒置顯微鏡觀察拍照。利用Image J 1.46軟件對(duì)縮窄距離進(jìn)行分析，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞的遷移率。遷移率=（初始劃痕寬度值-相應(yīng)點(diǎn)劃痕寬度值）/初始劃痕寬度值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組樣本比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)5-8F和6-10B中TRIM 29、SQSTM 1、RDX基因的m RNA表達(dá)水平

以5-8F細(xì)胞為參照，根據(jù)PCR各樣本的Ct值，運(yùn)用2-ΔΔCt法，相對(duì)于參照基因表達(dá)倍數(shù)為2-ΔΔCt，根據(jù)2-ΔΔCt做兩組細(xì)胞的基因相對(duì)折合表達(dá)量分析（見(jiàn)圖1）。結(jié)果顯示，TRIM 29、SQSTM 1 mRNA表達(dá)水平在5-8F細(xì)胞中顯著高于6-10B細(xì)胞，RDX mRNA表達(dá)水平在5-8F細(xì)胞中顯著低于6-10B細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 Western blot檢測(cè)5-8F和6-10B中TRIM 29、SQSTM 1、RDX基因的蛋白表達(dá)水平

5-8F細(xì)胞中TRIM 29、SQSTM 1的蛋白表達(dá)水平明顯高于6-10B細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果不僅證實(shí)了課題組前期的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果，也提示TRIM 29、SQSTM 1與NPC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)；但兩種細(xì)胞中RDX的蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與本研究前期的定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果不一致，見(jiàn)圖2。

2.3 TRIM 29特異性siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體抑制TRIM 29蛋白表達(dá)

圖1 TRIM 29、SQSTM 1、RDX在5-8F和6-10B細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平

圖2 TRIM 29、SQSTM 1和RDX在5-8F和6-10B細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平

根據(jù)3種基因在不同轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果，課題組對(duì)TRIM 29做進(jìn)一步研究。構(gòu)建TRIM 29特異性siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染5-8F，使TRIM 29表達(dá)沉默，Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。與未轉(zhuǎn)染的5-8F及轉(zhuǎn)染空白載體的5-8F細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染了干擾質(zhì)粒的5-8F細(xì)胞TRIM 29表達(dá)水平明顯降低；未轉(zhuǎn)染的5-8F和轉(zhuǎn)染空白載體的5-8F細(xì)胞比較，TRIM 29表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明轉(zhuǎn)染成功。見(jiàn)圖3。細(xì)胞增殖能力結(jié)果見(jiàn)表1及圖4。由結(jié)果可見(jiàn)，各組細(xì)胞第0天的吸光度值基本一致（P>0.05），從第1天開(kāi)始，5-8F/Si-TRIM 29細(xì)胞的吸光度值與5-8F細(xì)胞、5-8F/NC細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示從第1天起5-8F/Si-TRIM 29細(xì)胞增殖速度明顯減慢；5-8F細(xì)胞與5-8F/NC細(xì)胞的MTT吸光度值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖3 Western blot檢測(cè)TRIM 29蛋白表達(dá)水平

圖4 MTT檢測(cè)3種細(xì)胞增殖

2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

MTT檢測(cè)5-8F、5-8F/NC和5-8F/Si-TRIM 29

表1 MTT檢測(cè)3種細(xì)胞增殖的吸光度值（A490 nm） （±s）

表1 MTT檢測(cè)3種細(xì)胞增殖的吸光度值（A490 nm） （±s）

注：?與5-8F和5-8F/NC比較，P<0.05

細(xì)胞株 第0天 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天5-8F 0.145±0.011 0.190±0.028 0.337±0.014 0.772±0.049 1.277±0.093 1.842±0.119 1.876±0.065 5-8F/NC 0.150±0.009 0.206±0.028 0.340±0.035 0.790±0.054 1.287±0.080 1.749±0.129 1.863±0.121 5-8F/Si-TRIM 29 0.155±0.014 0.148±0.004?0.287±0.037?0.407±0.046?0.777±0.076?1.220±0.074?1.380±0.062?

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

流式細(xì)胞儀檢測(cè)3種細(xì)胞周期結(jié)果見(jiàn)圖5及表2。結(jié)果顯示，與5-8F細(xì)胞、5-8F/NC細(xì)胞相比，5-8F/Si-TRIM 29細(xì)胞表現(xiàn)為明顯的G0/G1期細(xì)胞增加，而S期細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；5-8F細(xì)胞與5-8F/NC細(xì)胞相比，各周期細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果提示TRIM 29低表達(dá)有抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的作用。見(jiàn)圖5。

2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

3種細(xì)胞0和48 h遷移情況見(jiàn)圖6。培養(yǎng)48 h后，與5-8F細(xì)胞、5-8F/NC細(xì)胞相比，5-8F/Si-TRIM 29細(xì)胞遷移能力明顯降低（P<0.05）；5-8F細(xì)胞和5-8F/NC細(xì)胞相比，遷移率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。5-8F細(xì)胞的遷移率為（0.733±0.012），5-8F/NC細(xì)胞的遷移率為（0.700±0.017），5-8F/Si-TRIM 29細(xì)胞的遷移率為（0.325±0.039），各組細(xì)胞遷移率比較見(jiàn)圖7。

圖5 5-8F、5-8F/NC和5-8F/si-TRIM 29細(xì)胞周期的分布

表2 5-8F、5-8F/NC和5-8F/Si-TRIM 29細(xì)胞周期的分布 （%，±s）

表2 5-8F、5-8F/NC和5-8F/Si-TRIM 29細(xì)胞周期的分布 （%，±s）

注：1）與5-8F比較，P<0.05；2）與5-8F/NC比較，P<0.05

細(xì)胞株 G0/G1期 S期 G2/M期5-8F 50.723±6.630 39.753±4.660 9.527±2.175 5-8F/NC 50.983±5.275 36.700±4.192 12.317±1.703 5-8F/Si-TRIM 29 69.530±5.1251）2） 23.313±4.9211）2） 7.157±1.3162）

圖6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5-8F、5-8F/NC和5-8F/Si-TRIM 29細(xì)胞的遷移能力

圖7 5-8F、5-8F/NC和5-8F/Si-TRIM 29細(xì)胞的遷移率比較

3 討論

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)是一種新的、功能強(qiáng)大的可同時(shí)對(duì)4種或8種樣品進(jìn)行絕對(duì)和相對(duì)定量研究的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，它具有高通量、高重復(fù)性、高敏感性和高精確性等特點(diǎn)。本課題組前期以5-8F和6-10B為模型，應(yīng)用iTRAQ標(biāo)記結(jié)合二維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（multi-dimensional liquid chromarography-mass spectrometry/mass spectrometry，2DLC-MS/MS）篩選出鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異蛋白190個(gè)，TRIM 29、SQSTM 1、RDX是其中3個(gè)在5-8F中較6-10B中表達(dá)上調(diào)的差異蛋白。

RDX是ERM（ezrin/radixin/moesin/merlin）家族成員，ERM家族為細(xì)胞骨架連接蛋白，ERM家族參與細(xì)胞生理狀態(tài)下的許多基本生命活動(dòng)如細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)偽足及微絨毛等的形成、細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等[6]。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)RDX在5-8F中較6-10B中表達(dá)上調(diào)，提示RDX可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。但本研究中qRT-PCR結(jié)果顯示RDX在6-10B中表達(dá)較5-8F中高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Western blot結(jié)果也顯示6-10B表達(dá)較5-8F中高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這種結(jié)果前后矛盾，因此課題組未對(duì)其與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系進(jìn)行下一步研究。出現(xiàn)這種情況的原因可能是iTRAQ為高通量地篩選細(xì)胞間差異表達(dá)蛋白的技術(shù)，影響因素很多，存在一定誤差。

SQSTM 1，也稱(chēng)p62，是一種含有多種結(jié)構(gòu)域的蛋白，有一些相互作用的結(jié)構(gòu)域，包括PB1二聚化結(jié)構(gòu)域、TRAF6結(jié)合位點(diǎn)和泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域等，因此是一種多功能的泛素化結(jié)合的折疊蛋白，其在自噬調(diào)控[7]、凋亡[8]、蛋白酶體通路[9]、NF-κB[10]、Wnt等[11]信號(hào)通路中起重要的作用，從而與多種腫瘤密切相關(guān)。研究報(bào)道[13]，其高表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[12]，低表達(dá)降低惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性。本研究發(fā)現(xiàn)，SQSTM 1的表達(dá)水平在5-8F中較6-10B中明顯上調(diào)，這與前期定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，再次證明SQSTM 1與鼻咽癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是預(yù)測(cè)鼻咽癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的一個(gè)重要的分子標(biāo)志物，關(guān)于它的促轉(zhuǎn)移作用及其具體機(jī)制將另文報(bào)告。

TRIM 29基因，又稱(chēng)為共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張D組相關(guān)基因（ataxia telang-iectasia group D-associated protein，ATDC），位于11q23，屬于TRIM蛋白家族，由588個(gè)氨基酸組成，其蛋白結(jié)構(gòu)含有多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)基序和1個(gè)亮氨酸拉鏈基序，可能是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[14]。文獻(xiàn)報(bào)道TRIM29在許多腫瘤中過(guò)表達(dá)，如肺癌[15]、胃癌[16]、膀胱癌等[17]。RU等[18]研究發(fā)現(xiàn)TRIM 29不僅促進(jìn)癌細(xì)胞體外增殖，而且加快胰腺腫瘤的生長(zhǎng)及體內(nèi)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，高轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌細(xì)胞系5-8F中TRIM 29的表達(dá)水平明顯上調(diào)，與低轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞系6-10B相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與課題組前期定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，說(shuō)明TRIM29與鼻咽癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。通過(guò)進(jìn)一步利用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)5-8F細(xì)胞中TRIM 29的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TRIM 29低表達(dá)后5-8F細(xì)胞的增殖能力降低，G0/G1期細(xì)胞增加，而S期細(xì)胞減少，說(shuō)明TRIM 29可能是通過(guò)調(diào)節(jié)G0/G1期到S期細(xì)胞的變化來(lái)影響細(xì)胞周期的變化，從而影響細(xì)胞增殖。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示TRIM 29低表達(dá)后5-8F細(xì)胞的遷移能力下降，再次證明TRIM 29在鼻咽癌細(xì)胞中的促轉(zhuǎn)移作用。有研究報(bào)道[19]，TRIM 29促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、宮頸鱗癌等腫瘤細(xì)胞的增殖與P53相關(guān)，其與P53相互作用，使P53駐留在細(xì)胞核外，并且抑制P53調(diào)節(jié)基因（P21和NOXA）的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。WANG等[20]發(fā)現(xiàn)TRIM29促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的一個(gè)糖原合成酶激酶3β 抑制劑穩(wěn)定β-catenin而實(shí)現(xiàn)的。而TRIM 29促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前尚未見(jiàn)報(bào)道，本課題組將進(jìn)行后續(xù)研究。

綜上所述，siRNA干擾TRIM 29表達(dá)能明顯抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，說(shuō)明TRIM 29在鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移中起重要作用。SQSTM 1也已證實(shí)與鼻咽癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此TRIM 29、SQSTM 1有望成為鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，但其分子機(jī)制及臨床應(yīng)用價(jià)值有待課題組進(jìn)一步深入研究。

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