陳秋生，李 近，周滿如，嚴文健，劉鈺瑜，許衛(wèi)銘

(廣東醫(yī)學院生理科學實驗室1、藥理學教研室2，廣東 湛江524023)

甘草酸對大鼠骨髓間充質干細胞體外成骨分化的影響

陳秋生1，李 近2，周滿如2，嚴文健2，劉鈺瑜2，許衛(wèi)銘2

(廣東醫(yī)學院生理科學實驗室1、藥理學教研室2，廣東 湛江524023)

目的觀察甘草酸對體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的影響。方法用傳代貼壁篩選的方法分離純化大鼠骨髓間充質干細胞。加藥后5 d、7 d、9 d用PNPP法觀察甘草酸對骨髓間充質干細胞(BMSCs)向成骨細胞方向分化的影響。用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測甘草酸對細胞骨鈣素(OCN)含量的影響。結果傳代貼壁篩選的方法可得到骨髓基質細胞，其間存在有間質干細胞，經誘導后可向成骨細胞方向分化。甘草酸可以增加大鼠骨髓間充質干細胞成骨誘導后細胞堿性磷酸酶和骨鈣素的含量，其中1×10-6mol/L濃度組作用7 d時效果明顯。結論甘草酸能促進大鼠骨髓間充質干細胞向成骨細胞方向分化。

甘草酸；骨髓間充質干細胞；成骨細胞；分化

甘草(Glycyrrhiza)為豆科植物甘草、脹果甘草和光果甘草的根及根莖，最早見于《神農本草經》，我國中醫(yī)因其具有補脾益氣，清熱祛痰等功效而譽為上品。甘草中的甘草酸(Glycyrrhizic acid，GA)是其最為重要的活性成分，有文獻報道它具有對抗炎癥、抗過敏、抗病毒、參與免疫調節(jié)作用、護肝、輔助促進吸收等功能[1]。研究表明，甘草的干燥根及根莖以及其提取物甘草酸以及其他甘草提取物都有較好的防治骨質疏松癥的作用[2-3]。我們課題組前期的預試也發(fā)現(xiàn)GA和雌激素聯(lián)合應用可增加骨羥脯氨酸的含量，增大骨斷裂載荷和最大載荷，改善去卵巢小鼠骨的結構，提升松質骨結構力學。但目前甘草酸對骨髓間充質干細胞成骨分化作用的研究較少，本實驗觀察甘草酸對大鼠骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖、成骨分化的影響，為研究利用甘草酸防治骨質疏松提供更多的科學實驗依據。本實驗時間為2013年1月至2014年7月。

1 材料與方法

1.1 材料 低糖培養(yǎng)基DMEM和高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(購自Gibco公司)；四硝基苯基磷酸二鈉鹽(PNPP)、L抗壞血酸、β甘油磷酸鈉、地塞米松和甘草酸標準品(購自Sigma公司)；骨鈣素檢測的ELISA試劑盒和堿性磷酸酶染色試劑盒(均購自南京建成生物有限公司)；NAPCO二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(5420-1，Precision Scientific，USA)；XD-101倒置相差顯微鏡(江南光電股份有限公司)；酶標儀：Bio-ELX-800型，美國。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離和培養(yǎng)1個月齡SD大鼠10只，雌雄各半，體重(70±10)g。頸部脫臼后，浸泡于75%酒精，超凈工作臺上無菌分離兩側的股骨，75%酒精浸泡，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸泡，去除軟組織后浸泡于低糖的DMEM中，用低糖DMEM沖洗股骨的骨髓腔，將收集沖洗出的細胞液1000 r/min離心10min后，棄上清液后，用含10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培養(yǎng)液以1×107/cm2密度接種到25cm2培養(yǎng)瓶中，24 h后首次半量更換培養(yǎng)液以去除懸浮細胞，以后每3～4 d全量換液1次，細胞70%～80%融合后采用胰酶消化傳代。取傳至第3代的間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)進行誘導分化實驗，每項實驗2次重復。

1.2.2 成骨誘導方法 成骨誘導組加入成骨誘導液。成骨誘導液包含β磷酸甘油10mmol/L、抗壞血酸50mg/L、地塞米松1×10-8mol/L。

1.2.3 堿性磷酸酶活性測定(PNPP法) 取96孔板，每孔2×104/cm2密度接種經傳3代的MSCs，每孔100 μl。培養(yǎng)48 h后誘導組加入成骨條件培養(yǎng)基，加藥組加入不同濃度的甘草酸，甘草酸終濃度分別為1×10-8mol/L、1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L。分別于藥物作用第5天、第7天、第9天測定細胞堿性磷酸酶含量。測定時，去掉培養(yǎng)液，PBS沖3遍，按試劑盒說明書操作，用酶標儀測定各孔405 nm波長下的吸光度值(OD405)。

1.2.4 ELISA法檢測骨鈣素(OCN)含量 將經傳3代的MSCs消化后，以1×104/cm2細胞數(shù)加入48孔板，次日加藥，分為空白對照組、成骨誘導組、不同濃度的甘草酸組。每3 d更換一次新鮮的培養(yǎng)液和藥物，收集7 d內的細胞培養(yǎng)液，按ELISA試劑盒說明檢測OCN的含量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，各組間資料比較采用t檢驗。SPSS11.0軟件行方差分析并行Bonferroni組間比較，雙側P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 骨髓間充質干細胞的鑒定 原代細胞在鏡下觀察，可看到多種細胞形態(tài)。24 h后原代取材的細胞開始貼壁。48 h后，大部分細胞已經貼壁展開，出現(xiàn)團簇集落。經傳代換液的方式純化后的BMSCs細胞呈均一的長梭形貼底部，局部呈漩渦形整齊排列(圖1)。成骨誘導后用堿性磷酸酶染色后有陽性細胞，證實所收集培養(yǎng)的細胞具有成骨分化能力(圖2)。

圖1 大鼠骨髓間充質干細胞一般形態(tài)(10×10)

圖2 大鼠骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)成骨誘導后經堿性磷酸酶染色的形態(tài)(10×4)

2.2 甘草酸對大鼠骨髓間充質干細胞增殖的影響 各組間細胞抑制率差異有統(tǒng)計學意義(F=4.047，P=0.0075)。1×10-4mol/L的甘草酸抑制了大鼠骨髓間充質干細胞的增殖，該濃度組大鼠骨髓間充質干細胞增殖抑制率在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后都顯著增高，與空白對照組和成骨誘導組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(F=47.01，P=0.0101；F=17.83，P=0.0409)，見表1。

表1 甘草酸對大鼠骨髓間充質干細胞增殖的影響(±s，%)

表1 甘草酸對大鼠骨髓間充質干細胞增殖的影響(±s，%)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與成骨誘導組比較，bP＜0.05。

組別 增殖抑制率0 h24 h48 h72 h空白對照組成骨誘導組GA1×10-8mol/L GA1×10-7mol/L GA1×10-6mol/L GA1×10-5mol/L GA1×10-4mol/L1.31±0.141.25±0.171.41±0.150.87±0.101.25±0.170.98±0.100.79±0.10ab2.74±0.252.91±0.342.84±0.343.52±0.394.38±0.345.27±0.798.87±1.49ab4.39±0.445.79±0.836.59±0.488.27±0.677.11±0.8310.32±1.2421.46±2.57ab6.71±0.729.85±1.229.01±0.7513.25±1.4311.17±1.2217.85±1.5437.25±3.07ab

2.3 甘草酸對大鼠骨髓間充質干細胞成骨誘導后堿性磷酸酶含量的影響 成骨誘導組的堿性磷酸酶含量升高，3 d時與對照組比較有極顯著的升高(P＜0.01)，在第7天達到高峰，第9天時開始回落。與對照組比較，1×10-8mol/L、1×10-7mol/L、1×10-5mol/L、和1×10-4mol/L濃度甘草酸無促進堿性磷酸酶表達的作用。1×10-6mol/L濃度的甘草酸可促進堿性磷酸酶表達，作用與成骨誘導組相當。堿性磷酸酶含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的延長而逐漸升高，在第7天達到高峰，第9天開始回落。其中1×10-6mol/L濃度的甘草酸作用7 d，藥物促進堿性磷酸酶表達的作用最明顯(F=4.311，P=0.0083)，見表2。

表2 甘草酸對大鼠骨髓間充質干細胞堿性磷酸酶含量的影響(±s，mol/L)

表2 甘草酸對大鼠骨髓間充質干細胞堿性磷酸酶含量的影響(±s，mol/L)

注：與對照組比較，aP＜0.01。

組別 堿性磷酸酶含量0 d3 d7 d9 d空白對照組成骨誘導組GA1×10-8mol/L GA1×10-7mol/L GA1×10-6mol/L GA1×10-5mol/L GA1×10-4mol/L0.2±0.020.01±0.010.01±0.020.01±0.020.01±0.03b0.01±0.010.01±0.010.3±0.030.48±0.020.25±0.030.27±0.030.51±0.04b0.29±0.020.23±0.020.45±0.050.69±0.030.46±0.040.49±0.030.68±0.04b0.51±0.030.44±0.030.42±0.040.5±0.040.44±0.040.44±0.050.63±0.05b0.43±0.050.38±0.05

2.4 甘草酸對大鼠骨髓間充質干細胞骨鈣素含量的影響 和對照組比較，成骨誘導組的骨鈣素含量升高(P＜0.01)而且呈持續(xù)增高。與空白對照組比較，1×10-8mol/L、1×10-7mol/L和1×10-4mol/L濃度甘草酸沒有促進骨鈣素濃度增高。1×10-6mol/L和1×10-5mol/L濃度的甘草酸可促進骨鈣素表達，作用與成骨誘導組相當。隨著培養(yǎng)天數(shù)的延長，骨鈣素含量逐漸升高。其中1×10-5mol/L濃度的甘草酸作用最明顯(F=2.900，P=0.043)，見表3。

表3 甘草酸對大鼠骨髓間充質干細胞骨鈣素含量的影響(±s，mol/L)

表3 甘草酸對大鼠骨髓間充質干細胞骨鈣素含量的影響(±s，mol/L)

分組 鈣素含量0 d3 d7 d9 d空白對照組成骨誘導組GA1×10-8mol/L GA1×10-7mol/L GA1×10-6mol/L GA1×10-5mol/L GA1×10-4mol/L0.3±0.030.32±0.030.28±0.020.28±0.020.33±0.020.29±0.030.31±0.031.19±0.151.69±0.181.28±0.121.37±0.121.83±0.191.89±0.21.48±0.121.35±0.112.01±0.211.39±0.131.49±0.132.17±0.222.2±0.241.59±0.191.51±0.192.17±0.231.58±0.181.69±0.182.34±0.282.4±0.271.75±0.21

3 討論

骨質疏松(Osteoporosis，OP)是一種主要特征為骨量減少、骨的微觀結構退化，從而導致骨強度降低、骨脆性增加而易發(fā)生骨折的全身性代謝骨病。隨著醫(yī)學技術高速發(fā)展，人民預期壽命獲得大幅延長。但也因此，骨質疏松癥也日漸成為常見病種而引起臨床重視[4]，如何預防和治療也成為骨相關學科的研究重點。能否從細胞水平研發(fā)藥物，促進干細胞向成骨細胞分化，從而逆轉骨質疏松過程，成為了防治骨質疏松癥的較有前途的方法之一。

骨髓間充質干細胞(MSC)是成人體內具有多向分化潛能的干細胞，它位于骨髓結締組織中。MSC可在不同誘導條件下分化為成骨細胞或脂肪細胞[5]。如果MSC向成骨分化減弱或者向成脂分化增強都會導致人體內骨量的減低，從而誘導產生骨質疏松癥。因此，如何逆轉這一過程，研發(fā)增強MSC向成骨轉化的藥物，已成為干細胞骨轉化相關的骨質疏松癥治療領域的目標。

如前言所述，甘草酸作為甘草重要成份，對骨代謝的影響及治療作用日益受到重視。本課題組發(fā)現(xiàn)，在甘草酸對抗小鼠肝纖維化及骨丟失的實驗中，一定劑量的甘草酸可增加四氯化碳小鼠模型的骨量和骨鈣，骨羥脯氨酸含量也同時增高3倍以上[6-7]。這說明甘草酸具有促成骨細胞生長以及分泌的功能，調控骨組織中的微量元素的含量，從而發(fā)揮抗肝纖維所致的骨質丟失。相關文獻也報道，甘草酸具有改善關節(jié)、修復骨膜損傷的功能[8]。此外，它還協(xié)助癸酸鈉促進細胞吸收降鈣素，從而抑制骨吸收[9]。其作用機制是降低上皮細胞膜兩側的電阻，增強結腸吸收降鈣素能力，從而提高藥物的生物利用度，使骨吸收和骨重建達到平衡狀態(tài)。去卵巢小鼠以甘草酸聯(lián)合雌激素處理后其第四腰椎最大載荷顯著增強[10]。此外，也有文獻報道老年性骨質疏松可以甘草附子湯等中醫(yī)治療[11-12]。這些均表明單獨使用甘草酸或與雌激素聯(lián)用可能有助于治療骨質疏松癥。但是甘草酸在成骨分化方面的詳細作用及機制、以及其在骨質疏松模型動物的詳細作用機制仍待闡明。

本研究聚焦于在細胞以及分子水平方面，甘草酸促成骨的詳細作用。實驗結果提示甘草酸具有促進MSCs向成骨細胞方向分化的作用。1×10-6mol/L的濃度可提高堿性磷酸酶活性。同時該濃度既可促進堿性磷酸酶表達，也可促進骨鈣素的分泌。成骨細胞早期發(fā)育階段特異性標志物就是堿性磷酸酶。它可抑制骨礦化過程中的無機焦磷酸鹽向無機磷水解，在細胞外基質礦化中起關鍵作用。它的活性高低可反映成骨細胞的成熟狀態(tài)。而成骨細胞晚期發(fā)育階段的標志物則是骨鈣素，同時它也是骨中最豐富的非膠原蛋白[13]。我們的研究結果說明，加入甘草酸后，MSC的堿性磷酸酶和骨鈣素的表達出現(xiàn)顯著提高。這說明甘草酸在MSC的成骨分化過程的早期和晚期，也就是骨分化的全過程均有一定的促進作用。而這也是甘草酸拮抗骨質疏松的可能作用機制。

甘草及甘草甜素的一系列風險及安全評估結果均表明甘草并無潛在的致畸、致突變等遺傳毒性。美國FDA、國際衛(wèi)生和糧農組織食品添加劑法規(guī)委員會等機構也均認為甘草和甘草提取物、如甘草甜素等屬于安全無毒物質。鑒于甘草酸幾乎沒有毒副作用，而我們的研究結果也表明其具有抗骨質疏松作用，它有望開發(fā)為高效低毒的抗骨質疏松藥物，將造福廣大骨質疏松患者。

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Effect of glycyrrhizic acid on differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro.

CHEN Qiu-sheng1,LI Jin2,ZHOU Man-ru2,YAN Wen-jian2,LIU Yu-yu2,XU Wei-ming2.Laboratory of Physiological Science1,Department of Pharmacology2,Guangdong Medical College,Zhanjiang524023,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo observe the effect of glycyrrhizic acid on proliferation and differentiation of cultured rat bone marrow mesenchymal stem cell.MethodsRat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and purified.On the5th,7th,9thday after medication,PNPP method was used to study the effects of glycyrrhizic acid on alkaline phosphatase,and ELISA was used to detect the effects of glycyrrhizic acid on osteocalcin secretion.ResultsBone marrow stromal cells were obtained through culture,in which the mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into osteoblasts.Glycyrrhizic acid could increase the levels of alkaline phosphatase and osteocalcin in rat bone marrow mesenchymal stem cells after osteogenic induction,and the effect was the most significant in cells treated with1×10-6mol/L glycyrrhizic acid for7 days.ConclusionGlycyrrhizic acid can promote rat bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into osteoblasts.

Glycyrrhizic acid;Bone marrow mesenchymal stem cells;Osteoblasts;Differentiation

R-332

A

1003—6350（2015）22—3281—03

2015-04-14)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.22.1192

湛江市科技攻關項目（編號：2012C3106021）；廣東省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（編號：1057112016）

許衛(wèi)銘。E-mail：642081529@qq.com