梁新劍，董少紅，羅林杰，李 軍

(深圳市人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 深圳 518020)

葡萄糖及胰島素對血管平滑肌凋亡的影響

梁新劍，董少紅，羅林杰，李 軍

(深圳市人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 深圳 518020)

目的 觀察不同濃度葡萄糖及胰島素對血管平滑肌細胞(VSMC)凋亡現(xiàn)象的抑制作用。方法采用酶消化法結(jié)合組織貼塊法培養(yǎng)胎兒主動脈VSMC，以3%H2O2誘導VSMC凋亡(H2O2組)。葡萄糖組以加入DMEM培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度不同分為對照組(1.5 g/L)和高糖組(4.5 g/L)；胰島素組根據(jù)加入的低糖DMEM培養(yǎng)基中胰島素的濃度不同，分為四組：0(對照組)、4×10-5IU/L組、4×10-4IU/L組、4×10-3IU/L組。每組均設置三個復孔，觀察6 h、12 h、24 h三個時間點上的SMC細胞的凋亡狀況。通過倒置相差顯微鏡CKX31及電鏡觀察細胞凋亡現(xiàn)象，同時利用Annexin-Ⅴ結(jié)合PI，流式細胞儀技術(shù)檢測細胞凋亡率。結(jié)果加入H2O2后VSMC出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。與對照組比較，H2O2組細胞凋亡率在各時間段明顯增加(P＜0.05)，24 h時凋亡率為(46.3±0.4)%，增加最為顯著(P＜0.05)；高糖組在6 h、12 h、24 h時凋亡率分別為(16.20±0.53)%、(23.47±0.55)%、(35.87±0.35)%，對照組分別為(20.50± 0.70)%、(30.23±0.51)%、(46.3±0.46)%，高糖組比較對照組顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；在四個濃度組的不同時間段，胰島素組與對照組相比凋亡率均顯著減少(P＜0.01)。隨著胰島素濃度的增加，細胞凋亡率有明顯降低的趨勢(P＜0.05)。結(jié)論高濃度葡萄糖和胰島素都可以抑制VSMC凋亡，且這一作用呈濃度依賴性。

葡萄糖；胰島素；血管平滑肌細胞；細胞培養(yǎng)；凋亡

目前在狹窄血管中血運重建特別是冠心病治療方法中經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)(Percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)和冠狀動脈旁路移植術(shù)(Coronary artery bypass grafting，CABG)是其中兩種主要的手術(shù)方法。自20世紀70年代，Grüntzig等[1-2]首先將PTCA應用于冠心病的治療。隨著技術(shù)的進步和經(jīng)驗積累，PTCA的適應證在不斷擴大，成功率也在不斷提高。經(jīng)過多年的臨床觀察和實踐證明：與CABG相比，PTCA在預后和治療費用上區(qū)別并不太大，但因PTAC無須開胸手術(shù)、對患者的損傷較小、安全性高、療效好等優(yōu)點，在臨床中尤其有獨特優(yōu)勢[3]。PTCA手術(shù)治療中的術(shù)后再狹窄(Restenosis，RS)一直是困擾醫(yī)護人員的一個重要問題，雖然經(jīng)過幾十年的發(fā)展，大量的藥理學和機械方法被用來減少再狹窄的發(fā)生率，但PTCA術(shù)后再狹窄問題依然很重要，尤其是對于高?；颊撸艽蟮南拗屏薖TCA的使用。

再狹窄一般被定義為與參照血管相比管內(nèi)直徑縮小大于50%，這種情況的出現(xiàn)取決于患者自身的遺傳背景和相關(guān)疾病，并影響到循環(huán)系統(tǒng)，包括糖尿病、高血壓和高膽固醇血癥。PTCA術(shù)后再狹窄的典型表現(xiàn)就是血小板凝集、生長因子的釋放、炎性細胞浸潤、內(nèi)膜平滑肌細胞的增殖和遷移及細胞外基質(zhì)的重塑。深入了解血管生理愈合的反應和術(shù)后再狹窄反應的分子機理，有助于研究發(fā)展出新的方法來控制病理性的新生內(nèi)膜的形成。2014年10～12月，我們利用體外培養(yǎng)獲得細胞，并通過流式細胞儀技術(shù)研究探討了葡萄糖和胰島素對胎兒主動脈平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)凋亡的誘導作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 低糖(1.5 g/L)DMEM培養(yǎng)基、高糖(4.5 g/L)DMEM培養(yǎng)基、小牛血清(HYCLONE，US)、胰島素(購自諾和諾德公司，批號：RVG0228)、鼠抗人單克隆抗體α-actin(Neumark，US)；流式細胞儀(Beckman Coulter Altra)；Annexin－V Fitc標記聯(lián)合PI凋亡檢測試劑盒(Imunotech)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)的血管平滑肌細胞(VSMC)來自于3個月齡水囊引產(chǎn)的胎兒。細胞的原代培養(yǎng)參考Campbell的貼塊法進行[4]。在組織培養(yǎng)一周后從邊緣取出細胞，繼續(xù)培養(yǎng)2～3周，當培養(yǎng)的細胞在鏡下可見典型的“峰-谷”樣生長時，使用鼠抗人α-actin免疫組化SABC法進行鑒定，證實所培養(yǎng)細胞為平滑肌細胞(SMC)，并無內(nèi)皮細胞及成纖維細胞污染。

1.2.2 培養(yǎng)細胞分組 選取對數(shù)生長期SMC細胞，加入到含1%小牛血清的低糖DMEM的培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)48 h，細胞進入增殖靜止階段。其后，加入20%小牛血清+低糖DMEM培養(yǎng)基，SMC培養(yǎng)細胞重新進入增殖生長周期。隨后加入含終濃度為3%H2O2誘導SMC的凋亡。葡萄糖組以加入DMEM培養(yǎng)基中葡萄糖濃度不同分為對照組(1.5 g/L)和高糖組(4.5 g/L)；胰島素組根據(jù)加入的低糖DMEM培養(yǎng)基中胰島素濃度的不同，分為四組：0(對照組)、4×10-5IU/L組、4×10-4IU/L組、4×10-3IU/L組。每組均設置三個復孔，觀察6 h、12 h、24 h三個時間點上的SMC細胞的凋亡狀況。

1.2.3 SMC培養(yǎng)細胞的形態(tài)學觀察 通過倒置相差顯微鏡CKX31及電鏡對各組凋亡細胞形態(tài)學的變化情況進行觀察。

1.2.4 流式細胞儀細胞凋亡率的檢測 收集消化各組不同時間段細胞，加入帶有綠色熒光的熒光探針FITC標記的Annexin V 5μl，避光染色10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，加碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色液10μl后使用流式細胞儀進行細胞凋亡情況檢測。Annexin-V+/PI-為凋亡細胞。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對本研究所采集數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。采用單因素方差分析不同時間H2O2對VSMC凋亡的影響、葡萄糖對VSMC凋亡的影響，組間比較采用配對t檢驗。不同時間不同濃度胰島素對VSMC凋亡的影響采用析因分析，并用F檢驗進行組間比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學 在倒置相差顯微鏡下可見有SMC培養(yǎng)細胞原有的貼壁延展的生長形態(tài)已不存在，而伴隨出現(xiàn)了體積變小、變圓，出現(xiàn)胞膜氣泡等明顯的凋亡現(xiàn)象，在高分辨率電鏡下可觀察到凋亡小體的存在，見圖1。

圖1 電鏡下可見凋亡小體等凋亡現(xiàn)象

2.2 流式細胞儀凋亡檢測結(jié)果

2.2.1 H2O2誘導凋亡 對照組與H2O2組隨著時間的延長，細胞凋亡率均逐漸增加。與對照組相比，H2O2組細胞凋亡率在各時間段明顯增加(P＜0.05)，24 h時凋亡率增加最為顯著(t=153.868，P＜0.0001)，見表1。

表1 不同時間H2O2對VSMC凋亡的影響(%，±s）

表1 不同時間H2O2對VSMC凋亡的影響(%，±s）

P值0.000 0.000F值922.328 1585.924組別對照組(n=3) H2O2組(n=3)t值P值6 h 0.98±0.23 20.50±0.70 45.886＜0.0001 12 h 2.81±0.24 30.23±0.51 84.259＜0.0001 24 h 4.86±0.24 46.3±0.4 153.868＜0.0001

2.2.2 葡萄糖組 從表2可看出，高糖組與對照組細胞凋亡率均隨著時間的延長而增加。在同一時間段，高糖組與對照組相比凋亡率明顯減少(P＜0.05)，24 h時下降最多(t=31.254，P＜0.000 1)。高糖組細胞凋亡率較對照組凋亡率有明顯的下降趨勢，見圖2。

表2 葡萄糖對VSMC凋亡的影響(%，±s）

表2 葡萄糖對VSMC凋亡的影響(%，±s）

組別對照組(n=3)高糖組(n=3)t值P值6 h 20.50±0.70 16.20±0.53 8.482 0.001 12 h 30.23±0.51 23.47±0.55 15.610＜0.0001 24 h 46.3±0.46 35.87±0.35 31.254＜0.0001F值1707.803 1259.453P值0.000 0.000

圖2 不同濃度葡萄糖對細胞凋亡的影響

2.2.3 胰島素組 從表3胰島素對VSMC凋亡的影響可見，對照組隨著時間的延長，細胞凋亡率明顯增加(P＜0.05)，各不同濃度組的細胞凋亡率隨著時間的延長也有增加，各組之間比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在各不同濃度組的不同時間段，胰島素組與對照組相比凋亡率均明顯減少(P＜0.05)。在同一時間段，隨著胰島素在4×10-5IU/L、4×10-4IU/L、4×10-3IU/L三個不同濃度組的凋亡率都呈現(xiàn)降低的趨勢，各濃度組之間凋亡率比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。3×4析因分析結(jié)果顯示隨著胰島素濃度的增加，凋亡率的降低差異具有統(tǒng)計學意義(F=3 205.971，P＜0.001)；隨著胰島素濃度的增加，培養(yǎng)SMC凋亡率有降低的趨勢，見圖3。

表3 胰島素對VSMC凋亡的影響(%，±s）

表3 胰島素對VSMC凋亡的影響(%，±s）

注：FA=3738.311，PA＜0.001；FB=3205.971，PB＜0.001；FA×B=158.383，PA×B＜0.001。

濃度(B)時間（A）24 h 6 h 12 h 46.30±0.46 29.63±0.67 25.27±0.50 16.07±0.64對照組(0，n=3) 4×10-5IU/L(n=3) 4×10-4IU/L(n=3) 4×10-3IU/L(n=3) 20.50±0.70 14.07±0.23 10.2±0.40 6.27±0.32 30.23±0.51 18.37±0.15 15.27±0.50 10.97±0.21

圖3 不同濃度胰島素對細胞凋亡的影響

3 討 論

冠脈支架術(shù)后再狹窄嚴重影響著冠心病尤其合并有糖尿病患者的預后，引起再狹窄的增殖細胞主要是平滑肌細胞。有研究指出血管平滑肌細胞在支架術(shù)后24 h開始增殖，在3～4 d內(nèi)處于增殖狀態(tài)的平滑肌細胞(SMC)開始部分向內(nèi)膜遷移，這一過程會持續(xù)數(shù)周至數(shù)月[5]。楚海榮等[6]發(fā)現(xiàn)高糖促進平滑肌細胞的遷移，在高糖環(huán)境下，平滑肌細胞由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)變。有研究也表明糖尿病患者的高血糖能促使血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)變、增殖及遷移能力增強[7]。平滑肌細胞的增殖啟動的同時，細胞凋亡也加速[8]。細胞凋亡受阻是許多慢性非腫瘤性增殖性疾病的主要發(fā)病原因[8]。還有研究發(fā)現(xiàn)高糖血癥可以促進血管平滑肌增殖，但其對SMC凋亡的影響尚不得而知[9]。而胰島素抵抗時，血管平滑肌細胞的增殖遷移受絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路調(diào)節(jié)[10]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度胰島素(100 nmol/L)誘導的血管平滑肌細胞增殖遷移伴有NADPH氧化酶活性增加及ROS的生成增多[11]。

本研究中，我們在離體培養(yǎng)條件下獲得了合成表型的平滑肌細胞。已有研究表明H2O2濃度超過225 pmol/L以后對細胞具有一定的毒性，抑制VSMC的增殖[12]，本研究與之相同，加入含終濃度為3%的H2O2后與對照組相比，H2O2組細胞凋亡率在各時間段明顯增加，確證了3%的H2O2可誘導SMC的凋亡。我們進一步檢測了高糖及胰島素對血管平滑肌細胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長細胞凋亡率都在增加(凋亡率是一個累加的過程)，而高糖組與對照組相比凋亡率明顯減少(P＜0.05)，從趨勢圖也可看出隨著時間的延長高糖組細胞凋亡率較對照組凋亡率有明顯的下降趨勢。說明高糖對H2O2誘導的VSMC凋亡有一定的抑制作用。與此同時，我們通過3個時間段、4個不同濃度胰島素對H2O2誘導的VSMC凋亡進行了分析，結(jié)果表明隨著胰島素濃度的增加，凋亡率具有降低的趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(F=3 205.971，P＜0.001)。說明高濃度胰島素對H2O2誘導的VSMC也有一定的抑制作用，而且這一作用隨著胰島素濃度的增加而增加。目前已有的研究也顯示葡萄糖可能通過影響激酶的磷酸化來影響SMC的細胞增殖和凋亡[13]，而胰島素可能是通過激活蛋白激酶B(PKB或者Akt)途徑來調(diào)控SMC的細胞增殖和凋亡[14]。因此糖尿病患者高血糖及胰島素抵抗繼發(fā)的高胰島素血癥對VSMC凋亡的抑制作用有可能是再狹窄發(fā)生的一個重要環(huán)節(jié)。

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Influence of glucose and insulin on apoptosis of vascular smooth muscle cell.

LIANG Xin-jian,DONG Shao-hong, LUO Lin-jie,LI Jun.Department of Cardiology,Shenzhen People's Hospital,Shenzhen 518020,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo observe the influence of glucose and insulin on apoptosis of vascular smooth muscle cell(VSMCs)cultured from the thoracic aortas of the aborted fetusin vitro.MethodsVSMCs from the thoracic aortas of the aborted fetus were culturedin vitro,and 3%H2O2was applied to induce apoptosis(H2O2group).Different concentrations of glucose and insulin for the different incubation time was applied for intervention of apoptosis.According to the concentration of glucose in DMEM medium,glucose group were divided into the glucose control group (1.5 g/L)and the high sugar group(4.5 g/L).According to the concentration of insulin in DMEM medium,insulin group were divided into four groups:0(insulin control group),4×10-5IU/L group,4×10-4IU/L group,4×10-3IU/L group.Each group have three holes.The apoptosis of SMC cells was observed on three time points:6 h,12 h,24 h. The apoptosis rate was detected by Annexin-V combined with PI,flow cytometry.ResultsApoptosis was observed after induction by 3%H2O2.Compared with the control group,the apoptosis rates of H2O2group was significantlyhigher at each time point(P＜0.05),with the apoptosis rate at 24 h of(46.3±0.4)%,which was increased most significantly.At the same time point,the apoptosis rate was descended in high glucose group[(16.20±0.53)%,(23.47±0.55)%, (35.87±0.35)%at 6 h,12 h,24 h,respectively),compared with the glucose control group[(20.50±0.70)%,(30.23± 0.51)%,(46.3±0.46)%],P＜0.05.For insulin group,the apoptosis rate of 4×10-5IU/L group,4×10-4IU/L group,4×10-3IU/L group was significantly lower than that in insulin control group(P＜0.01).With the increase of the concentration of insulin,the apoptosis rate reduced significantly(P＜0.05).ConclusionHigh levels of glucose and insulin may inhibit apoptosis of VSMC,with concentration-dependent effect.

Glucose;Insulin;Vascular smooth muscle cell(VSMC);Cell culture;Apoptosis

R977.1+5

A

1003—6350（2015）23—3436—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.23.1247

2015-05-18)

梁新劍。E-mail：13430783949@139.com