潘嫵姍，何永成，陳洪滔

（1.廣州醫(yī)科大學研究生院，廣東 廣州 510182；2.深圳市第二人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 深圳 518035）

miR-200a和miR-155在狼瘡性腎炎患者腎組織中的表達及其作用機制探討

潘嫵姍1，何永成2，陳洪滔2

（1.廣州醫(yī)科大學研究生院，廣東 廣州 510182；2.深圳市第二人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 深圳 518035）

目的 探討miR-200a及miR-155在狼瘡性腎炎(LN)患者腎組織中的表達及其在LN發(fā)病機制中的作用。方法通過實時熒光定量聚合酶鏈反應測定30例LN患者和15例健康對照組腎組織中miR-200a及miR-155的表達水平。結(jié)果LN患者腎組織中miR-155的表達水平高于健康對照組，miR-200a的表達水平低于健康對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。LN患者腎組織中miR-200a的表達水平與狼瘡評分呈負相關(guān)(r=-0.391，P=0.032)，miR-200a的表達水平與尿蛋白呈負相關(guān)(r=-0.395，P=0.034)。miR-155與狼瘡評分呈正相關(guān)(r=0.593，P=0.001)，miR-155表達水平與尿蛋白呈正相關(guān)(r=0.375，P=0.045)，miR-155的表達水平與eGFR呈負相關(guān)（r=-0.59，P=0.001）。miR-200a的表達水平與eGFR之間無明顯相關(guān)性(r=0.22，P=0.242)。結(jié)論腎組織中miR-155和miR-200a在狼瘡性腎炎患者與健康對照組之間的表達水平有差異，且它們的表達水平與蛋白尿、腎功能及狼瘡評分均相關(guān)。提示LN患者組織中miR-200a與miR-155的表達與LN患者腎功能惡化和狼瘡疾病活動程度密切相關(guān)，可作為預測LN進展的重要標志物。

狼瘡性腎炎；miR-155；miR-200a

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種多系統(tǒng)自身免疫性疾病，它的特征是靶向核的自身抗體的產(chǎn)生引起了多器官的廣泛免疫病理損害。免疫復合物沉積在腎小球則導致狼瘡性腎炎(LN)的發(fā)生[1]。microRNAs (miRNAs)是一種內(nèi)源性、非編碼、單鏈長度為18～24個核苷酸的小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達[2]。多種miRNA在狼瘡性腎炎患者與健康對照組之間的表達存在差異[3]。有研究表明LN患者血清和尿液中的多種miRNAs水平與健康對照組相比存在差異。而另外一些研究證實，腎活檢組織中LN患者的miRNAs與健康對照組相比，一部分miRNAs表達下調(diào)而另外一部分miRNAs表達上調(diào)[4]。本研究應用熒光實時定量PCR(RT-PCR)方法研究LN患者腎組織中miR-155及miR-200a的表達情況，尋找與LN相關(guān)的生物學標記物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年4月至2014年1月間在我院經(jīng)腎穿刺活檢診斷為LN的患者30例。選取了被切除腎癌組織且沒有任何形態(tài)學證據(jù)表明存在腎臟疾病的15例健康腎組織作為對照。臨床資料包括血清補體水平、血清肌酐、尿蛋白、血清超敏C-反應蛋白(hsCRP)等，腎穿刺活檢當天的狼瘡活動程度由系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動指數(shù)評分(SLEDAI)[5]來評估，腎小球濾過率(eGFR)由MDRD方程評估。

1.2 主要試劑 miRSOL body fluid miRNA isolation kit(Cat.No.AB-MIS-001，AB-MIS-002)(深圳市盎然生物技術(shù)有限公司，中國)；S-Poly(T)miRNA qPCR-assay(Cat.No.AB-MAS100001-AB-MAS86581) (深圳市盎然生物技術(shù)有限公司，中國)。.

1.3 主要儀器 Real-time PCR儀(ABi7300)；低溫臺式離心機(Sigma公司，德國)。

1.4 研究方法

1.4.1 miRNA提取 按miRSOL body fluid miRNA isolation kit說明書操作進行RNA提取。每個石蠟組織切除20 μm切片共10片置于EP管中，在放油石蠟組織的EP管中加入適量的RNAiso Plus后勻漿，室溫靜置5 min，12 000 r/min 4℃離心5 min，上清液移至新的1.5 ml EP管中。加入1/5 RNAiso Plus體積量的氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈振蕩20 s后室溫靜置5 min，之后12 000 r/min 4℃離心15 min。從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，無色的上清液含miRNA。吸取500 μl上清液轉(zhuǎn)移至另一新的1.5 ml離心管中，向上清液中加入等體積的異丙醇(500μl)，上下顛倒充分混勻，室溫靜置10 min后12 000 r/min 4℃離心10 min。棄去上清液，向沉淀中加入1 ml的75%乙醇，輕輕顛倒，清洗沉淀后12 000 r/min 4℃離心5 min，棄上清。最后沉淀室溫干燥2～3 min，加入10μ1 RNase-free水溶解，溶解產(chǎn)物置于-80℃儲存。

1.4.2 miRNA的逆轉(zhuǎn)錄 按照S-Poly(T)miRNAqPCR-assay試劑盒說明書操作，將提取的miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按說明書將miRNA10 μl加入反應體系中。miR-200a和miR-155逆轉(zhuǎn)錄反應條件：37℃保溫30 min，42℃保溫30 min，75℃加熱5 min，冰上放2 min。逆轉(zhuǎn)錄后可進行熒光實時定量PCR。

1.4.3 熒光實時定量PCR 按S-Poly(T)miRNA qPCR-assay試劑盒說明書操作進行熒光實時定量PCR。整個反應體系20 μl，cDNA稀釋5倍，10× selfTaqBuffer 2 μl，2 mmol/L、dNTP mix 2 μl，SelfTaqPolymerase 0.5 μl，10μmol/L正向引物0.4 μl，10μmol/L反向引物(5 862)0.4μl，10μmol/L探針0.5 μl，ROX Reference Dye(100X，Sigma)0.2μl，稀釋cDNA 8 μl，6μl，每一個miRNA做2次。反應條件：95℃30 s 1個循環(huán)；95℃10 s，60°C 30 s 40個循環(huán)。在Real-time PCR儀(ABi7300)上進行熒光實時定量PCR。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析 以外源snor44為內(nèi)參，表達量以2^-ΔCt表示，其中ΔCt=AVG(檢測的miRNA)-AVG(內(nèi)參基因)；采用副孔檢測，AVG為檢測miR-200a及miR-155CT值。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。服從正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗。不服從正態(tài)分布定量資料以中位數(shù)和極值表示，兩組間比較采用秩和檢驗。指標間量變關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人口學及臨床資料比較 本組30例LN患者中男女比例為1:29；平均年齡(30.57±10.82)歲，GFR為(97.66±40.29)ml/(min·1.73 m2)，24 h尿蛋白定量(2.54±2.48)g，C3水平(0.55±0.26)g/L，C4水平(0.06±0.03)g/L，C反應蛋白(5.09±5.03)mg/L，狼瘡評分為(15.47±4.86)分。30例LN患者中，3例組織學診斷為系膜增生型(Ⅱ型)，2例為局灶節(jié)段型(Ⅲ型)，20例為彌漫增生型(Ⅳ型)，2例為(Ⅳ+Ⅴ型)，3例為膜型(Ⅴ型)。

2.2 LN患者與健康對照組腎組織中miRNA的表達水平比較 LN患者腎組織中miR-155的表達水平高于健康對照組，miR-200a的表達水平低于健康對照組，且差異均具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見圖1。

2.3 LN患者腎組織中miRNA表達與臨床指標之間的相關(guān)性 腎組織中miR-155(r=-0.59，P=0.001)與eGFR呈負相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。miR-200a(r=0.22，P=0.242)的表達水平與eGFR無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，見圖2。腎組織中miR-155(r= 0.593，P=0.001)表達水平與狼瘡評分呈正相關(guān)，miR-200a(r=-0.391，P=0.032)的表達水平與狼瘡評分呈負相關(guān)，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖3。腎組織中miR-155(r=0.375，P=0.045)表達水平與尿蛋白呈正相關(guān)，miR-200a(r=-0.395，P=0.034)的表達水平與尿蛋白呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖4。

圖1 LN患者與健康對照組腎組織中miRNA的表達

圖2 LN患者腎組織miRNA水平與GFR之間的相關(guān)性

圖3 LN患者腎組織miRNA水平與狼瘡評分之間的相關(guān)性

圖4 LN患者腎組織miRNA水平與尿蛋白之間的相關(guān)性

3 討論

最近的一些研究證實，miRNAs能夠在各種來源，例如組織，血清和其他體液中被檢測到。miRNAs在各種惡性和非惡性疾病，包括癌癥，炎癥和自身免疫性疾病中的作用是顯而易見的，并且有越來越多的證據(jù)證明miRNA在SLE及LN中也發(fā)揮了重要作用[6]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)腎組織中miR-155及miR-200a的表達水平在LN患者和正常對照組之間存在差異，并且，miRNA表達水平的改變與臨床疾病的嚴重程度密切相關(guān)。結(jié)果表明，這些miRNA的表達可能在LN的發(fā)病機制中起一定作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，相比健康對照者或非活動性SLE患者，活動性SLE患者循環(huán)中調(diào)節(jié)性T細胞在其他CD4+T細胞中的比例下降得到了證實。調(diào)節(jié)性T細胞缺陷也被證明了與疾病的嚴重度相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，對比非自身免疫性小鼠，MRL/lpr小鼠調(diào)節(jié)性T細胞中的miR-155有所上調(diào)[7]。miR-155和miR-155*可以共同調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素在漿細胞樣樹突細胞的產(chǎn)生，為狼瘡性腎炎的發(fā)病提供了潛在依據(jù)[8]。Te等[9]發(fā)現(xiàn)血清miR-155的表達水平在SLE患者中比健康對照組降低，而在非裔美國人外周血單個核細胞中它的表達水平上調(diào)。Wang等[10]測定了40例LN患者尿液沉渣中的miR-155水平并與13名健康對照組比較，發(fā)現(xiàn)LN患者尿液沉渣中miR-155的表達水平顯著升高，且與蛋白尿程度及狼瘡評分呈正相關(guān)。

腎臟損害是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最嚴重的并發(fā)癥之一，有相當一部分的患者伴隨有蛋白尿和腎功能異常。在LN腎間質(zhì)纖維化的進程中，腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化(EMT)發(fā)揮著重要的作用[11]。研究表明E-box抑制因子1(ZEB1)和E-box抑制因子2(ZEB2)能與上皮細胞內(nèi)的E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)基因的啟動子序列中的E-box(CACCTC/G)序列結(jié)合而抑制其轉(zhuǎn)錄，從而促進EMT的發(fā)生[12]。Wang等[13]測定40例LN患者血清和尿液中的miRNAs水平并與健康對照組相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清與尿液中的miR-200家族(比如miR-200a、miR-141)、miR-205和miR-192，可以抑制ZEB1或ZEB2的表達。這些miRNA在LN患者血清中的表達下調(diào)，而miR-200家族、miR-192在LN患者尿液中的水平下調(diào)。血清中的miR-200a與蛋白尿程度呈負相關(guān)，并且與狼瘡評分呈負相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，組織中miR-155的表達水平在狼瘡性腎炎患者中高于健康對照組，并且它的表達水平與eGFR呈負相關(guān)，與尿蛋白及狼瘡評分呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義。miR-200a腎組織中的表達水平在狼瘡性腎炎患者中低于健康對照組，miR-200a的表達水平與尿蛋白及狼瘡評分呈負相關(guān)，與eGFR之間無明顯相關(guān)關(guān)系?？偟膩碚f，我們的研究結(jié)果提示LN患者腎組織中miR-200a、miR-155表達水平的差異與LN患者腎功能惡化和狼瘡疾病活動程度密切相關(guān)，可作為預測LN進展的重要標志物。

本研究有自身的局限性。第一，由于標本量較小，我們沒有足夠的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)進行狼瘡性腎炎組織學分型之間的比較，需要較大樣本來做進一步研究。第二、本研究是單中心橫斷面研究，未對同一患者治療前后做重復腎穿刺活檢，從而對療效進行前瞻性研究，還需要搜集更多臨床數(shù)據(jù)做進一步研究。

綜上所述，LN患者腎組織中miR-155的表達水平高于健康對照組，且其表達水平與eGFR呈負相關(guān)，與尿蛋白及狼瘡評分呈正相關(guān)。LN患者腎組織中miR-200a的表達水平低于健康對照組，miR-200a的表達水平與尿蛋白及狼瘡評分呈負相關(guān)。腎組織中miR-200a、miR-155表達水平的差異與LN患者腎功能惡化和狼瘡疾病活動程度密切相關(guān)，可作為預測LN進展的重要標志物。

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Expression of miR-200a and miR-155 in renal tissue of patients with lupus nephritis and its mechanisms.

PAN Wu-shan1,HE Yong-cheng2,CHEN Hong-tao2.1.Graduate School,Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,Guangdong,CHINA;2.Department of Nephrology,Shenzhen Second People's Hospital,Shenzhen 518035, Guangdong,CHINA

Objective To investigate the expression of miR-200a and miR-155 in the renal tissue of patients with lupus nephritis(LN),and to analyze its role in the pathogenesis of LN.MethodsWe quantified the expression level of miR-200a and miR-155 in the renal tissue of 30 patients with LN and 15 healthy controls through real-time PCR.ResultsCompared with health controls,the miR-155 level in LN patients was higher,and miR-200a level in LN patients was lower,with statistically significant difference(P＜0.001).miR-200a expression was negatively correlated with proteinuria(r=-0.395,P=0.034)and SLEDA(r=-0.391,P=0.032).miR-155 expression was positively correlated with proteinuria(r=0.375,P=0.045)and SLEDA(r=0.593,P=0.001),while miR-155 expression was nagatively correlated with estimated GFR(r=-0.5,P=0.001).miR-200a expression showed no significant correlation with estimated GFR (r=0.22,P=0.242).ConclusionThe miR-155 and miR-200a are differentially expressed in the renal tissue of LN patients and normal controls,and their expressions are closely related to the proteinuria,renal function and SLEDA.miR-155 and miR-200a expression in renal tissue are closely related to the degree of deterioration of renal function and lupus disease activity,which can serve as important targets in the pathogenesis of lupus nephritis.

Lupus nephritis;miR-155;miR-200a

R593.24+2

A

1003—6350（2015）10—1423—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.10.0509

2014-05-08)

何永成。E-mail：heyongcheng@medmail.com.cn