戴穎欣，　李　敏

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科, 上海 200127)

MALDI-TOF MS在臨床微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用

戴穎欣，李敏

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科, 上海 200127)

摘要：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是一種軟電離質(zhì)譜，適用于分析蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)，可用來(lái)繪制微生物的蛋白質(zhì)圖譜，達(dá)到鑒定的目的。基于MALDI-TOF MS的蛋白質(zhì)譜技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、敏感性高、高通量等特點(diǎn)，目前已應(yīng)用于細(xì)菌和真菌的鑒定，其在微生物耐藥性分析、分型和毒力研究等科研領(lǐng)域的應(yīng)用也初有成效，尚有巨大的發(fā)展空間。本文就以MALDI-TOF MS為代表的蛋白質(zhì)譜技術(shù)在微生物檢驗(yàn)和科研中的應(yīng)用作一綜述。

關(guān)鍵詞：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；微生物；檢驗(yàn)；科研

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)02-0102-06R446.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.002

Abstract:Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is one kind of soft ionization mass spectrometry, which is suitable for the analysis of bio-macromolecule, such as protein. It can be used for microbial identification by mapping the microbial protein mass spectra. Since MALDI-TOF MS technology is well-known for its rapidity, accuracy, high sensitivity and high throughput, it has been applied in bacterium and fungus identifications. MALDI-TOF MS also has a good performance in the field of scientific research, including resistance analysis, bacterium typing and virulence study，and there is still a large space for development. In this paper, we reviewed the application of MALDI-TOF MS technology in microbial identification and scientific research.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目(81322025、81171623、81371875)；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年人才計(jì)劃(XYQ2011039)；上海市曙光人才計(jì)劃項(xiàng)目(12SG03)

作者簡(jiǎn)介：戴穎欣，女，1992年生，碩士，主要從事病原微生物致病機(jī)制研究。

通訊作者：李敏，聯(lián)系電話：021-68383297。

收稿日期：(2014-10-24)

Application of MALDI-TOF MS technology in clinical microbial determinationDAIYingxin,LIMin.(DepartmentofClinicalLaboratory,RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Key words: Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry; Microbiology; Determination; Scientific research

病原微生物引起的感染性疾病嚴(yán)重威脅著人類健康，近年來(lái)隨著抗菌藥物濫用導(dǎo)致多種細(xì)菌耐藥以及部分新型細(xì)菌的出現(xiàn)使形勢(shì)更加嚴(yán)峻。傳統(tǒng)的微生物鑒定方法主要是基于表型的檢測(cè)，包括革蘭染色、微生物培養(yǎng)和生化試驗(yàn)等，因時(shí)間較長(zhǎng)、鑒定范圍窄，影響了病原微生物鑒定的速度和準(zhǔn)確性，在一定程度上阻礙了感染性疾病的控制。因此，臨床上急需快速而準(zhǔn)確的病原微生物鑒定方法以改善感染性疾病患者療效。近年來(lái)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅猛，其中基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的支柱技術(shù)，在推動(dòng)微生物蛋白組學(xué)發(fā)展的同時(shí)，也為基于蛋白質(zhì)指紋圖譜的微生物鑒定奠定了基礎(chǔ)。MALDI-TOF MS是一種新興的軟電離質(zhì)譜，用于繪制微生物的蛋白質(zhì)譜峰圖譜，將臨床微生物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與已知微生物的標(biāo)準(zhǔn)蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，達(dá)到鑒定的目的。由于其具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、自動(dòng)化及高通量等特點(diǎn)，MALDI-TOF MS已成為一項(xiàng)高效的微生物快速鑒定技術(shù)被用于歐洲的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室，并將逐步取代常規(guī)的檢測(cè)方法。本文就以MALDI-TOF MS為代表的蛋白質(zhì)譜技術(shù)在微生物檢驗(yàn)和科研中的應(yīng)用作一綜述。

一、MADLI-TOF MS的基本原理

MALDI-TOF MS主要由三部分組成：(1)樣本解析/電離室；(2)飛行時(shí)間質(zhì)譜分析器；(3)粒子探測(cè)器[1]。MALDI-TOF MS的基本原理是將微生物樣本與等量的基質(zhì)溶液混合或分別點(diǎn)加在樣品靶盤(pán)上，溶劑揮發(fā)后形成樣本與基質(zhì)的共結(jié)晶；利用激光作為能量來(lái)源輻射結(jié)晶體，基質(zhì)從激光中吸收能量使樣本吸附，基質(zhì)與樣本之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣本分子電離；樣本離子在加速電場(chǎng)下獲得相同的動(dòng)能，經(jīng)高壓加速、聚焦后進(jìn)入飛行時(shí)間質(zhì)譜分析器進(jìn)行質(zhì)量分析，將檢測(cè)到的離子峰為縱坐標(biāo)，離子質(zhì)荷比(m/z)為橫坐標(biāo)，形成質(zhì)量圖譜，通過(guò)軟件分析比較，篩選并確定出特異性指紋圖譜，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)微生物種或菌株的區(qū)分和鑒定。MALDI-TOF MS可用于分析多種類型的樣本，包括有機(jī)分子溶液、核酸、蛋白質(zhì)以及整個(gè)微生物，其中蛋白質(zhì)和微生物是目前在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣的項(xiàng)目[2]。

二、MADLI-TOF MS在微生物鑒定中的應(yīng)用

MADLI-TOF MS是一種軟電離技術(shù)，特別適用于分析蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子物質(zhì)。它可以直接分析完整的蛋白質(zhì)分子而不需要進(jìn)一步粉碎，正是這一特點(diǎn)使其在分析完整微生物的蛋白質(zhì)譜方面具有很大的優(yōu)勢(shì)[1]。由于所得到的蛋白質(zhì)圖譜中主要的分子離子峰為菌體內(nèi)高豐度、表達(dá)穩(wěn)定且進(jìn)化保守的核糖體蛋白，因此，其鑒定結(jié)果穩(wěn)定、可靠。用于微生物鑒定的樣本既可以是分離培養(yǎng)的純菌落，也可以是原始的臨床樣本[3]。樣本可以濃縮、純化或是進(jìn)行一些預(yù)處理以提純蛋白，也可以不經(jīng)任何處理直接用于檢測(cè)[1]。常規(guī)的臨床微生物檢測(cè)往往需要對(duì)大量不同的樣本進(jìn)行鑒定，這對(duì)MADLI-TOF MS的準(zhǔn)確度和工作效率提出了挑戰(zhàn)，目前已有許多研究對(duì)MADLI-TOF MS的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了評(píng)估。

(一)MADLI-TOF MS對(duì)細(xì)菌的鑒定

SENG等[4]使用MADLI-TOF MS和常規(guī)方法鑒定來(lái)自臨床的1 660個(gè)菌株，用16S rRNA測(cè)序補(bǔ)充鑒定不明確的菌株。結(jié)果顯示 MADLI-TOF MS準(zhǔn)確鑒定了95.4%的菌株，其中84.1%鑒定到種的水平，11.3%鑒定到屬的水平，一開(kāi)始未能鑒定的菌株在其蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)得到補(bǔ)充后也鑒定正確。MADLI-TOF MS被VAN VEEN等[5]用于臨床樣本的高通量檢測(cè)和前瞻性驗(yàn)證研究，他們首先用MADLI-TOF MS鑒定327個(gè)已知菌株，在菌屬水平上得到95.1%的正確率，隨后對(duì)980個(gè)臨床菌株進(jìn)行MADLI-TOF MS和常規(guī)生化系統(tǒng)的平行試驗(yàn)，結(jié)果兩者在菌種水平上鑒定的正確率分別為92.2%和83.1%，證實(shí)了MADLI-TOF MS在鑒定菌種的準(zhǔn)確性上優(yōu)于常規(guī)生化系統(tǒng)。

除了對(duì)大量隨機(jī)樣本進(jìn)行檢測(cè)以外，部分研究還分別對(duì)不同種類的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定。其中，革蘭陽(yáng)性球菌主要以葡萄球菌和鏈球菌為代表。DUBOIS等[6]用MADLI-TOF MS對(duì)包含22種葡萄球菌的152個(gè)菌株進(jìn)行了鑒定，其中99.3%(151/152)鑒定到種的水平。在近期一項(xiàng)研究中，Vitek MS v2.0 system (MALDI-TOF MS)從非肺炎鏈球菌種群中準(zhǔn)確地區(qū)分出了肺炎鏈球菌，116株非肺炎鏈球菌中只有1株(<1%)被錯(cuò)判[7]。MALDI-TOF MS為這些具有挑戰(zhàn)性的微生物鑒定提供了一種快速而簡(jiǎn)便的方法。臨床上常見(jiàn)的革蘭陰性桿菌主要包括腸桿菌和非發(fā)酵菌。HE等[8]使用基于MADLI-TOF MS的Biotyper system對(duì)從605份糞便樣本中選出的304個(gè)可疑菌落進(jìn)行了鑒定，其中包含22株沙門(mén)菌、39株志賀菌、3株腸出血性大腸埃希菌、2株小腸結(jié)腸耶爾森菌、2株彎曲菌和236株胃腸道正常菌群菌株。該系統(tǒng)正確鑒定出了沙門(mén)菌、小腸結(jié)腸耶爾森菌和彎曲菌，但是由于志賀菌、腸出血性大腸埃希菌和大腸埃希菌三者的特征性質(zhì)譜高度相似，它們并未被準(zhǔn)確鑒別。236株腸道正常菌群菌中，233株(98.7%)和228株(96.6%)分別鑒定到屬和種的水平。值得一提的是，該研究的對(duì)象都是直接挑選自選擇培養(yǎng)基上的可疑菌落，并未經(jīng)過(guò)純化，這將常規(guī)2~3 d的鑒定周期縮短到了孵育后的24 h內(nèi)，由此表明Biotyper system可以作為篩選工具直接用于鑒定原始選擇培養(yǎng)基上的菌落。除了腸桿菌科細(xì)菌外，非發(fā)酵菌由于其較低的生化反應(yīng)活性和不同的形態(tài)，在使用常規(guī)表型方法檢測(cè)時(shí)常常產(chǎn)生錯(cuò)誤的鑒定結(jié)果。 DEGAND等[9]使用MADLI-TOF MS對(duì)非發(fā)酵菌進(jìn)行了鑒定，先用包含多個(gè)菌種的一系列參考菌株的蛋白質(zhì)譜作為基礎(chǔ)建立非發(fā)酵菌的圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，再分別對(duì)臨床的非發(fā)酵菌進(jìn)行鑒定，得到了較高的準(zhǔn)確率。此外，為了推動(dòng)MADLI-TOF MS在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的普及，MELLMANN等[10]還聯(lián)合8個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)MADLI-TOF MS在非發(fā)酵菌鑒定方面的室間重復(fù)性進(jìn)行了驗(yàn)證。8個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)60株秘密編碼的非發(fā)酵菌進(jìn)行檢測(cè)，最終得到98.75%的室間重復(fù)性。

分枝桿菌的鑒定是臨床微生物檢測(cè)的重要部分，但是由于不同的菌種生長(zhǎng)時(shí)間不同，加上其嚴(yán)苛的生長(zhǎng)條件、較長(zhǎng)的培養(yǎng)周期和較低的生長(zhǎng)率，使分枝桿菌的鑒定成為臨床微生物檢測(cè)的一大難題。雖然分子探針和DNA雜交技術(shù)等相對(duì)快速而簡(jiǎn)便，但也因?yàn)橹会槍?duì)有限的幾種分枝桿菌而使其應(yīng)用受到限制。最近已有研究將MADLI-TOF MS運(yùn)用于分枝桿菌的鑒定。NIITSUMA等[11]使用MADLI-TOF MS對(duì)臨床分離的158株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTC)和37株非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculousMycobacteria，NTM)進(jìn)行了鑒定，鑒定結(jié)果顯示MTC在種和屬的水平上準(zhǔn)確率分別達(dá)到94.9%和99.4%，NTM在屬的水平上準(zhǔn)確率達(dá)到了94.6%。周昭彥等[12]則對(duì)15株臨床分離株和68株環(huán)境分離株NTM進(jìn)行了鑒定，通過(guò)比較3種樣本前處理和蛋白抽提方案建立了MADLI-TOF MS快速鑒定NTM的方法并進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

此外，MADLI-TOF MS還為一些特殊的、難鑒定的、甚至是新型的重組細(xì)菌提供了一條新的檢測(cè)思路。如以脆弱擬桿菌為代表的厭氧菌，常涉及不同來(lái)源的混合感染，而脆弱擬桿菌群的分離株表型十分相似，加上生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)較需氧菌慢，常規(guī)和自動(dòng)化的表型方法經(jīng)常將其誤判。NAGY 等[13]對(duì)277株擬桿菌屬臨床分離株進(jìn)行鑒定，有270株(97.5%)被明確鑒定，其中23株的結(jié)果有別于表型鑒定方法，11株經(jīng)測(cè)序后證實(shí)了MADLI-TOF MS的正確性。而XIAO等[14]則運(yùn)用MADLI-TOF MS在重組細(xì)菌的鑒定中進(jìn)行了大膽嘗試，提出MADLI-TOF MS不僅可以作為鑒定重組細(xì)菌的一種快速、準(zhǔn)確、高通量的方法，還為突變菌株甚至生物恐怖細(xì)菌的鑒定提供了新的可能。

(二)MADLI-TOF MS對(duì)真菌的鑒定

臨床上由機(jī)會(huì)致病菌引起的侵襲性真菌感染逐漸增多，尤其是在免疫力低下的患者中，這是引起高發(fā)病率和病死率的重要原因。由于傳統(tǒng)的生化方法不僅耗時(shí)而且需要相當(dāng)?shù)膶I(yè)知識(shí)，因此臨床上迫切需要快速、可靠的方法來(lái)鑒定真菌和輔助抗真菌藥物的治療。MARKLEIN等[15]對(duì)臨床分離的267株真菌(包括250株念珠菌和其他的隱球菌、酵母菌、毛孢子菌等)分別用MADLI-TOF MS、常規(guī)表型及生化方法進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，MADLI-TOF MS準(zhǔn)確鑒定了247株(92.5%),剩余的20株真菌在參考數(shù)據(jù)庫(kù)得到補(bǔ)充后均被準(zhǔn)確鑒定，整個(gè)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有假陽(yáng)性存在。STEVENSON等[16]對(duì)MADLI-TOF MS用于臨床重要酵母菌種的快速鑒定進(jìn)行了評(píng)估，他們創(chuàng)建了參考酵母菌株的圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(包括8個(gè)屬44種)，并對(duì)194個(gè)(含6屬23種)臨床菌株進(jìn)行鑒定以測(cè)試數(shù)據(jù)庫(kù)的準(zhǔn)確性，其中192個(gè)(99.0%)菌株被MADLI-TOF MS準(zhǔn)確鑒定。除了單一的評(píng)價(jià)MADLI-TOF MS在真菌鑒定中的作用，ZHANG等[17]使用基于MADLI-TOF MS的Vitek MS System和以核糖體DNA測(cè)序?yàn)檫x擇性補(bǔ)充，作為侵襲性真菌監(jiān)測(cè)的參考方法。該研究選取2011年中國(guó)醫(yī)院侵襲性真菌監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)上患有侵襲性真菌感染的患者作為樣本來(lái)源，共收集到1 243株菌株(代表31種酵母菌)用于分析，Vitek MS v2.0 system的鑒定結(jié)果與內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔(internal transcribed spacer，ITS)區(qū)序列分析(酵母菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行比較。經(jīng)Vitek MS v2.0 system鑒定，96.7%的菌株準(zhǔn)確鑒定到種的水平，0.2%鑒定到屬的水平，而2.4%和0.7%的菌株分別未能鑒定和被錯(cuò)判。經(jīng)重復(fù)測(cè)試后，菌種水平上的準(zhǔn)確率達(dá)到97.3%。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合Vitek MS system和核糖體DNA測(cè)序，99.7%的菌株得以準(zhǔn)確鑒定，這為真菌感染監(jiān)控的戰(zhàn)略計(jì)劃提供了切實(shí)可行的方法。

(三)MADLI-TOF MS對(duì)臨床樣本的直接鑒定

MADLI-TOF MS在微生物鑒定中的優(yōu)勢(shì)除了其本身具有的快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)外，還體現(xiàn)在可檢測(cè)樣本的多樣性，除了臨床分離得到的菌株，還可以直接用于原始樣本的檢測(cè)，其中以陽(yáng)性血培養(yǎng)和尿液樣本為主要代表。

快速的病原菌檢測(cè)對(duì)于血流感染的診斷和治療有著極其重要的臨床價(jià)值。血培養(yǎng)和鑒定是菌血癥病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，而目前微生物實(shí)驗(yàn)室血培養(yǎng)和鑒定需要較長(zhǎng)時(shí)間孵育，報(bào)告結(jié)果時(shí)間長(zhǎng)，遠(yuǎn)不能滿足臨床對(duì)血流感染快速診斷的需要，MADLI-TOF MS有望解決這一問(wèn)題。LA SCOLA 等[18]采用MADLI-TOF MS對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中的細(xì)菌直接進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示由自動(dòng)化系統(tǒng)鑒定為陽(yáng)性并且只含一種細(xì)菌的562個(gè)血培養(yǎng)樣本中，370個(gè)(66%)被準(zhǔn)確鑒定，未能鑒定的樣本大多數(shù)都是草綠色鏈球菌。而在另外22個(gè)含有2種或2種以上菌種的陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中，只有1個(gè)菌種被鑒定正確。其它的研究也指出陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本在直接鑒定中存在問(wèn)題，一是草綠色鏈球菌與肺炎鏈球菌不易鑒別，還有混合菌血培養(yǎng)樣本難以鑒定或容易錯(cuò)判[19]。此外，在MADLI-TOF MS直接鑒定陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本的一些報(bào)道中有數(shù)據(jù)提示，MADLI-TOF MS的準(zhǔn)確鑒定需要細(xì)菌濃度達(dá)到一定的標(biāo)準(zhǔn)(>107/mL)[20]。

尿培養(yǎng)是臨床上診斷尿路感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，因?yàn)槠淇梢酝瑫r(shí)兼顧病原體的鑒定和定量。但這種方法往往時(shí)間長(zhǎng)并且成本較高，為了縮短時(shí)間和降低成本，F(xiàn)ERREIRA等[3]將MADLI-TOF MS用于臨床尿液樣本的直接鑒定，樣本處理只需要2次離心分別除去白細(xì)胞和收集細(xì)菌，簡(jiǎn)便易行。結(jié)果表明MADLI-TOF MS可以在短時(shí)間內(nèi)高度準(zhǔn)確地鑒定感染性尿液樣本，并且針對(duì)有較高菌量計(jì)數(shù)(>105CFU/mL)的革蘭陰性菌樣本效果顯著。

三、MADLI-TOF MS在科研中的應(yīng)用

MADLI-TOF MS不僅在臨床微生物鑒定中發(fā)揮著重要的作用，而且在微生物科研領(lǐng)域也有很大的應(yīng)用前景。

(一)用MADLI-TOF MS進(jìn)行細(xì)菌耐藥性分析

MADLI-TOF MS可以用來(lái)快速檢測(cè)抗菌藥物的耐藥性。近年來(lái)甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-susceptibleStaphylococcusaureus，MSSA)的鑒別診斷對(duì)于臨床治療是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。已有部分研究將MADLI-TOF MS用于鑒定MRSA，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MRSA和MSSA在500～3 500 m/z范圍內(nèi)的質(zhì)譜存在差異[21-22]，并且質(zhì)譜圖譜準(zhǔn)確地分為2個(gè)單獨(dú)的組(即MRSA和MSSA)[22]。而隨著頭孢菌素類抗菌藥物的廣泛使用，我國(guó)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases，ESBLs)的比率居高不下，探索快速檢測(cè)革蘭陰性桿菌耐藥性的方法十分重要。CAMARA等[23]使用MADLI-TOF MS鑒定野生型和氨芐西林耐藥的大腸埃希菌，結(jié)果檢測(cè)到氨芐西林耐藥的大腸埃希菌約在29 000 m/z處有一個(gè)特異性峰值，最后證實(shí)該峰值對(duì)應(yīng)β-內(nèi)酰胺酶。近兩年，MADLI-TOF MS也開(kāi)始用于革蘭陰性桿菌β-內(nèi)酰胺酶尤其是碳青霉烯酶的檢測(cè)[24]。除了細(xì)菌的耐藥性相關(guān)檢測(cè)，MARINACH等[25]將MADLI-TOF MS的應(yīng)用拓展到一項(xiàng)新的方法用作白念珠菌的藥物敏感性試驗(yàn)，該試驗(yàn)通過(guò)分析白念珠菌在不同濃度的氟康唑下蛋白圖譜的變化來(lái)檢測(cè)其對(duì)氟康唑的敏感性，結(jié)果顯示蛋白圖譜發(fā)生明顯改變的最低藥物濃度(minimal profile change concentration，MPCC)與美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的參考方法得到的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)值高度一致。

(二)用MADLI-TOF MS進(jìn)行分型和毒力研究

細(xì)菌種類繁多，且同種細(xì)菌常常有多種血清型，不同型別的細(xì)菌其生理生化特性可能存在明顯差異，致病性等方面也可能完全不同。因此，對(duì)同一種細(xì)菌進(jìn)行快速分型是臨床微生物研究的一項(xiàng)重要課題。由于質(zhì)譜圖具有菌株特異性，MADLI-TOF MS可用于細(xì)菌的分型。WOLTERS 等[26]對(duì)MRSA菌株的質(zhì)譜圖進(jìn)行分級(jí)聚類分析，發(fā)現(xiàn)MADLI-TOF MS分型結(jié)果與spa分型結(jié)果有很好的一致性。近期還有研究表明，MADLI-TOF MS可用于區(qū)分?jǐn)y帶vanB基因的萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌(vancomycin-resistantEnterococcus，VRE)與萬(wàn)古霉素敏感株，提示其在VRE分型中的潛在作用[27]。而MALDI-TOF MS對(duì)沙門(mén)菌、大腸埃希菌、霍亂弧菌和副溶血性弧菌等多血清型細(xì)菌進(jìn)行鑒定和分類也得到了初步應(yīng)用,在沙門(mén)菌分型中表現(xiàn)出較好的分型能力。但是，由于目前MADLI-TOF MS在微生物分型方面尚未規(guī)范化和普及，因此還有很大的研發(fā)空間。與此同時(shí)，對(duì)于臨床上所關(guān)注的細(xì)菌毒力問(wèn)題，MADLI-TOF MS也有少部分涉及。殺白細(xì)胞素(panton-valentine leukocidin，PVL)是金黃色葡萄球菌中一種典型的毒力因子 ，BITTAR等[28]在研究中發(fā)現(xiàn)帶有PVL的金黃色葡萄球菌有特異性的4 448 m/z峰,而PVL陰性的金黃色葡萄球菌無(wú)此峰,用該方法可快速檢測(cè)PVL陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌,檢測(cè)的敏感性可達(dá)100.0%,特異性達(dá)90.6%。

(三)用MADLI-TOF MS分析潛在的生物標(biāo)志物

除了在微生物耐藥性分析、分型以及毒力等方面的應(yīng)用外，MADLI-TOF MS還可用于分析細(xì)菌或疾病中存在的生物標(biāo)志物。近期一項(xiàng)研究借助MADLI-TOF MS發(fā)現(xiàn)了MRSA和萬(wàn)古霉素中介的金黃色葡萄球菌(vancomycin-intermediateStaphylococcusaureus，VISA)的1 774.1 m/z和1 792.1 m/z 2個(gè)峰，它們所對(duì)應(yīng)的2種多肽存在于絕大部分社區(qū)獲得性MRSA(community-acquired MRSA，CA-MRSA)中，而醫(yī)院獲得性MRSA(hosiptal-acquired MRSA，HA-MRSA)中則幾乎沒(méi)有，所以這2個(gè)多肽可作為區(qū)分CA-MRSA和HA-MRSA的生物標(biāo)志物[29]。

四、總結(jié)和展望

以MADLI-TOF MS為代表的蛋白質(zhì)譜技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、高通量等特點(diǎn)，加上其自動(dòng)化和低消耗的優(yōu)勢(shì)而逐漸在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室被推廣，并且有望在不久的將來(lái)取代傳統(tǒng)的微生物鑒定方法。但是，現(xiàn)階段MADLI-TOF MS在微生物鑒定中還存在一定的局限性，如微生物蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)不夠完善，一些罕見(jiàn)菌種或新型細(xì)菌的圖譜尚未被現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，從而導(dǎo)致鑒定困難；含有混合菌種的血培養(yǎng)樣本難以準(zhǔn)確鑒別；同一菌屬中相近的菌種容易錯(cuò)誤鑒定；直接鑒定時(shí)，血培養(yǎng)和尿液樣本中菌量對(duì)鑒定的影響；以及各臨床實(shí)驗(yàn)室間由于培養(yǎng)習(xí)慣(培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等)的差異對(duì)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的影響，這些問(wèn)題都亟待解決?；蛟S我們可以通過(guò)完善數(shù)據(jù)庫(kù)、規(guī)范微生物的前處理、建立標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)流程提高準(zhǔn)確性，還可以與部分常規(guī)方法相結(jié)合，最大程度上發(fā)揮蛋白質(zhì)譜技術(shù)的作用。與此同時(shí)，MADLI-TOF MS已在微生物相關(guān)研究中嶄露頭角，它在今后的科研應(yīng)用中還有很大的提升空間，有望在微生物耐藥機(jī)制研究、細(xì)菌毒力因子研究、亞型分型等方面發(fā)揮更大的效用。隨著蛋白質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，相信在不久的將來(lái)，它一定會(huì)成為微生物鑒定和科研領(lǐng)域的一大支柱。

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(本文編輯：姜敏)