白 睿，劉惠亮

1解放軍總醫(yī)院/解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2武警總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，北京 100039

心臟脫細(xì)胞基質(zhì)在心肌組織工程中的應(yīng)用

白 睿1，劉惠亮2

1解放軍總醫(yī)院/解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2武警總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，北京 100039

近年來，心臟脫細(xì)胞基質(zhì)材料成為心肌組織工程領(lǐng)域炙手可熱的明星，其低致敏性和最接近天然的三維結(jié)構(gòu)顯示了其在修復(fù)、替代壞死心肌和器官再造方面的廣闊應(yīng)用前景。本篇綜述著眼于心臟脫細(xì)胞基質(zhì)在心肌梗死治療以及全器官再造等方面的研究，從心臟脫細(xì)胞基質(zhì)的制備、檢測和應(yīng)用方面進(jìn)行了系統(tǒng)回顧，并探討該材料今后的應(yīng)用前景與方向。

心臟脫細(xì)胞基質(zhì)；心肌組織工程；心肌梗死；器官再造

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-04-03 16:33 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150403.1633.007.html

脫細(xì)胞基質(zhì)是通過物理、化學(xué)和生物方法將天然組織的細(xì)胞成分全部清除，而完整保留的細(xì)胞支架及細(xì)胞外基質(zhì)成分。近年來，脫細(xì)胞基質(zhì)由于最接近天然的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞特定微環(huán)境及低致敏性等優(yōu)點，受到廣大學(xué)者的青睞。從1999年O'Brien等［1］開始探索并制備脫細(xì)胞基質(zhì)作為人工主瓣膜以來，研究人員一直在尋求其最佳的制備方法。近10年，心臟脫細(xì)胞的方法不斷改善并日益成熟，為其在心肌組織工程方面的應(yīng)用打下了堅實的基礎(chǔ)。目前，心臟脫細(xì)胞基質(zhì)主要用于體外心臟組織、器官再造以及體內(nèi)移植研究。本文從心臟脫細(xì)胞基質(zhì)的制備、評價和應(yīng)用三方面探討該材料的應(yīng)用前景與方向。

1　心臟脫細(xì)胞基質(zhì)的制備

制備脫細(xì)胞基質(zhì)的基本原理就是利用多種方法將心臟內(nèi)駐留的細(xì)胞成分全部破壞并清除，同時盡可能完整地保留心臟的支架及血管結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluar matrix，ECM）成分［包括膠原、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）、黏連蛋白和多種小分子活性物質(zhì)等］［2-3］。目前脫細(xì)胞常用物理、化學(xué)、酶解等方法。通過對這些方法的綜合應(yīng)用，最終達(dá)到破壞細(xì)胞膜、清除核酸和其他細(xì)胞成分的目的［4］。

1.1 物理洗脫法 物理洗脫即利用冷凍、直接沖洗、超聲法和攪拌法等方法將細(xì)胞成分去除。對于較為堅韌的組織（如肌腱、韌帶等），快速冷凍法最為常用［5-6］?？焖倮鋬隹梢允菇M織和細(xì)胞內(nèi)部形成大量冰晶，從而達(dá)到迅速破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞溶解的目的。通過這種暴力的方法破壞細(xì)胞還不夠，要徹底洗脫細(xì)胞成分，還需再利用沖洗法通過灌流液在器官脈管結(jié)構(gòu)內(nèi)不斷地循環(huán)沖洗，方可達(dá)到目的［7］。對于較為柔軟的組織（肺、肝等），直接用沖洗法灌流即可去除大部分細(xì)胞成分。另外，超聲和攪拌法通常會結(jié)合化學(xué)洗脫法一起進(jìn)行。利用超聲或攪拌首先使細(xì)胞物理破碎，再利用化學(xué)洗滌劑將破碎的細(xì)胞成分逐漸洗脫［8-9］。而心臟是介于堅韌和柔軟之間的器官，其脫細(xì)胞通常不會采用過于暴力的方法，以免破壞結(jié)構(gòu)。

1.2 化學(xué)洗脫法 可用于洗脫的化學(xué)物質(zhì)種類繁多，最常見的有酸堿洗脫法、高滲-低滲溶液洗脫法和洗滌劑洗脫法。酸堿洗脫的原理均是利用化學(xué)酸/堿性環(huán)境破壞分子結(jié)構(gòu)，最終達(dá)到清除細(xì)胞的目的。其中，過氧乙酸是一種薄層組織常用的酸性洗脫劑，它能夠在清除核酸成分的同時較好地保留細(xì)胞外基質(zhì)成分［10-11］。而醋酸則會溶解膠原成分，但對GAG保留較為完整。另外，堿性洗劑（氫氧化鈣、氫氧化鈉、硫化鈉等）作用強(qiáng)烈，對細(xì)胞和ECM破壞較大，多被用在真皮組織早期的毛發(fā)脫除上［12-13］。高滲-低滲洗脫原理主要是利用高滲鹽溶液溶解DNA，而低滲液使細(xì)胞溶解，從而清除細(xì)胞成分。在實際應(yīng)用中，經(jīng)常將組織在高滲-低滲液中交替浸泡而達(dá)到洗脫目的。洗滌劑是指非離子、離子和兩性離子洗滌劑，包括Triton-X100、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）等。其作用溫和，易于操作，是目前針對心臟最常用的洗脫法。Triton-X100是代表性非離子洗滌劑，它能有效地分離細(xì)胞膜-膜連接和膜-蛋白連接，而對蛋白-蛋白連接破壞較小。實驗中應(yīng)用Triton-X100洗脫時間差異很大，從幾個小時到幾天不等，這主要是根據(jù)具體的器官組織和聯(lián)合洗脫效果而定，如果洗脫時間過長，也會對層黏連蛋白和GAG造成破壞［9，14-16］。離子洗滌劑的代表是SDS，它對細(xì)胞的破壞作用強(qiáng)于Triton-X100，更適合洗脫較為堅韌的器官。但是使用SDS洗脫必須要更加嚴(yán)格地控制時間及濃度，否則SDS容易破壞ECM的超微結(jié)構(gòu)并使生長因子大量流失［17-19］。目前心臟脫細(xì)胞多聯(lián)合應(yīng)用SDS和Triton-X100。兩性洗滌劑作用介于上述二者之間，常用的試劑有CHAPS［9］、SB-10、SB16等［20-21］，它們主要用于動脈和神經(jīng)的脫細(xì)胞過程，并且常與Triton-X100聯(lián)合應(yīng)用。

1.3 生物酶洗脫法 生物酶洗脫是利用酶解作用破壞細(xì)胞膜從而清除細(xì)胞成分的方法。常見的酶試劑有核酸酶、胰酶、膠原酶、Dispase酶等。通常針對不同細(xì)胞成分使用對應(yīng)的酶能夠使其高效降解，另外還可以清除不需要的ECM組分。然而需要注意的是，殘留的酶成分會降解ECM，甚至引起繼發(fā)的免疫反應(yīng)。核酸酶包括DNA酶和RNA酶，是針對核苷酸序列的高效酶，主要用于組織溶解后核酸成分的清除［3，20］。胰酶是一種強(qiáng)效的絲氨酸蛋白酶，對于細(xì)胞和GAG破壞效果小，但對膠原和彈力蛋白作用強(qiáng)烈，可用于洗脫的初始階段，用來破壞組織超微結(jié)構(gòu)，以利于其他洗脫劑的滲入，但要避免其對組織的過度破壞。膠原酶可破壞組織結(jié)構(gòu)，只用于不需要保留組織結(jié)構(gòu)的洗脫［22］。

以上幾種脫細(xì)胞方法各有優(yōu)缺點，實際應(yīng)用中為了達(dá)到理想洗脫效果，通常會采用聯(lián)合洗脫策略。另外，根據(jù)洗脫目的選擇適當(dāng)?shù)南疵摬呗裕谙疵撨^程中逐漸摸索最佳的濃度和時間是脫細(xì)胞過程最重要的環(huán)節(jié)之一。

2　心臟脫細(xì)胞基質(zhì)的評價

心臟脫細(xì)胞是否成功，主要從以下幾個方面評價：細(xì)胞成分是否被完全清除、心臟ECM成分水平如何、心臟三維結(jié)構(gòu)和脈管結(jié)構(gòu)是否保存完整等。細(xì)胞成分的清除是脫細(xì)胞最重要的目的之一，殘余的細(xì)胞成分會在體外培養(yǎng)細(xì)胞時引起細(xì)胞相容性問題，在體內(nèi)應(yīng)用時引發(fā)宿主免疫反應(yīng)，其中最主要的是一些雙鏈DNA成分。雖然很難做到完全清除，但必須小于一定比例才不會引起前述問題。一般可以利用檢測試劑盒將脫細(xì)胞基質(zhì)中DNA提取出來，分光光度儀半定量檢測，或免疫熒光染色（DAPI/H&E）后在顯微鏡下觀察。目前公認(rèn)的安全標(biāo)準(zhǔn)：1）干重每毫克ECM中雙鏈DNA重量＜50 ng；2）免疫熒光染色（DAPI/H&E）后顯微鏡下無可見的細(xì)胞核成分［23］。確認(rèn)細(xì)胞成分清除后，制備的心臟脫細(xì)胞基質(zhì)ECM成分是否得以最大程度保留就成為我們接下來關(guān)心的問題。心臟ECM包括膠原、GAG、彈力蛋白、纖維蛋白、層黏連蛋白和生長因子等，目前并沒有各個成分含量的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，每個實驗團(tuán)隊通過不同的脫細(xì)胞方法得到的數(shù)值也不盡相同，但我們可以通過Western blotting、ELASA檢測、質(zhì)譜分析等方法對各個成分做初步的定量分析，根據(jù)實驗?zāi)康呐袛嘀苽涞拿摷?xì)胞基質(zhì)是否能夠滿足需要。

在全器官再造研究中，能夠完整保留全心臟脫細(xì)胞基質(zhì)三維骨架結(jié)構(gòu)和脈管結(jié)構(gòu)是再細(xì)胞化的首要前提，也是全器官再造的最大亮點。一般可通過大體觀察，或利用顯微鏡/掃描電鏡觀察評價心臟脫細(xì)胞基質(zhì)的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及脈管結(jié)構(gòu)，還可以通過主動脈逆行灌流的方法將染料從主動脈注入，心臟的各級脈管結(jié)構(gòu)即可清晰地顯示出來。

3　心臟脫細(xì)胞基質(zhì)在心肌組織工程研究中的應(yīng)用

目前，脫細(xì)胞基質(zhì)在心肌組織工程上的應(yīng)用主要分為3個方向：1）基于脫細(xì)胞基質(zhì)片層的“創(chuàng)可貼”心肌組織工程研究；2）基于脫細(xì)胞基質(zhì)的可注射性心肌組織工程研究；3）基于心臟全器官脫細(xì)胞-再細(xì)胞化的人工心臟再造研究。

3.1 基于脫細(xì)胞基質(zhì)片層的“創(chuàng)可貼”心肌組織工程研究1999年，O'Brien等［1］利用脫細(xì)胞基質(zhì)制備人工主動脈瓣膜，并成功移植入山羊體內(nèi)，由此開啟了人們對脫細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)用的探索之路。之后，人們陸續(xù)將脫細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)用于各個領(lǐng)域。2011年，Godier-Furn é mont等［24］將人骨髓干細(xì)胞加入生長因子TGFβ，種植在心臟脫細(xì)胞基質(zhì)-纖維蛋白水凝膠片層上，構(gòu)建了“創(chuàng)可貼”式心肌補(bǔ)片，首次將脫細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)用于心肌梗死的干細(xì)胞治療。研究表明，工程心肌組織片層能夠促進(jìn)旁分泌因子如生長因子的分泌，由此加強(qiáng)了干細(xì)胞的生長和分化，并明顯增加了心肌梗死部位新生血管的生成。同年，Ng等［25］研究了人胚胎干細(xì)胞以及人胚胎干細(xì)胞來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在心臟脫細(xì)胞基質(zhì)是的生長分化。在靜置培養(yǎng)兩周后，干細(xì)胞開始表達(dá)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志，由此證明了脫細(xì)胞基質(zhì)能夠促干細(xì)胞向心肌分化。然而將該材料植入大鼠體內(nèi)后，卻發(fā)現(xiàn)表達(dá)心肌標(biāo)記物的心肌片層并沒有收縮功能。因此，關(guān)于利用脫細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建心肌組織片層的研究還有很多問題需要明確，如怎樣使干細(xì)胞在脫細(xì)胞材料上更好地分化并具有功能性將成為未來研究的重點方向。

3.2 基于脫細(xì)胞基質(zhì)的可注射性心肌組織工程研究 脫細(xì)胞-再細(xì)胞化心肌片層只能用于外科治療修復(fù)心肌，在臨床上創(chuàng)傷大、風(fēng)險高，應(yīng)用受到很大限制。而可注射性水凝膠則能通過內(nèi)科微創(chuàng)注射的方法將材料或者細(xì)胞遞送到心肌梗死部位，其微創(chuàng)、安全、可控性強(qiáng)等優(yōu)點大大擴(kuò)展了脫細(xì)胞基質(zhì)材料在臨床的應(yīng)用。水凝膠種類繁多，常見的有藻酸鹽、纖維蛋白水凝膠、膠原、殼聚糖、脫細(xì)胞基質(zhì)等。其中，脫細(xì)胞基質(zhì)材料致敏性低，含有豐富的生物活性成分，其水凝膠形式能夠作為可注射性支架材料攜帶干細(xì)胞，不但能夠提供最天然的細(xì)胞外微環(huán)境，而且可以提高干細(xì)胞在體內(nèi)的滯留率，調(diào)節(jié)其生物學(xué)行為。2009年，Singelyn等［26］首次將心臟脫細(xì)胞基質(zhì)制備成水凝膠形式，詳細(xì)測定了水凝膠中各個成分及其含量，并證明了其良好的生物相容性，揭示了其巨大的臨床應(yīng)用潛力。2011年，Duan等［27］進(jìn)一步將心臟脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠（ECM）與Ⅰ型膠原（collagen，COL）復(fù)合培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞，研究表明，與單純膠原相比，ECM∶COL=3∶1（V∶V）時干細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)記物cTnT明顯升高。而且肌鈣蛋白Ⅰ和細(xì)胞連接蛋白Cx43的表達(dá)增高也證明了ECM能夠促進(jìn)干細(xì)胞的成熟，另外，ECM培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞中具有功能收縮特性的細(xì)胞數(shù)量明顯增多且收縮力增強(qiáng)，也表明了ECM使分化成熟的胚胎干細(xì)胞具備良好的收縮功能。2012年，Seif-Naraghi等［28］用心包脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠攜帶肝素結(jié)合生長因子，證明了可注射材料能夠使生長因子在缺血心肌組織內(nèi)有效滯留，并顯著加強(qiáng)了心肌梗死區(qū)域新生血管的形成。次年，該團(tuán)隊進(jìn)一步證實了可注射性脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠在心肌梗死治療方面的安全性及有效性［29］。同年，Singelyn等［30］用NOGA-guided MyoStar導(dǎo)管在大鼠心肌梗死部位注射心臟脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠，結(jié)果表明，注射部位內(nèi)源性心肌細(xì)胞明顯增加，且具有良好的收縮功能，并成功應(yīng)用于豬心肌梗死模型上，為脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)一步的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

3.3 基于心臟全器官脫細(xì)胞-再細(xì)胞化的人工心臟再造研究 對于終末期心衰的患者，器官移植是唯一有效的治療方法。然而供體短缺和受體免疫排斥反應(yīng)都制約著器官移植的發(fā)展。近年來，基于心臟全器官脫細(xì)胞-再細(xì)胞化的人工心臟再造研究的出現(xiàn)和發(fā)展，給心衰終末期患者帶來了新的希望。2008年，Ott等［7］首次報道了大鼠心臟的成功再造，一舉震驚世界。他們首先對大鼠心臟進(jìn)行脫細(xì)胞處理：利用1% SDS+1% Trion-X100聯(lián)合洗脫，從主動脈逆行灌注，SDS持續(xù)12 h灌注后，可見大鼠心臟逐漸透明，1% Trion-X100灌注0.5 h后，H&E染色及電鏡觀察可見心臟的細(xì)胞成分基本完全洗脫，瓣膜及血管結(jié)構(gòu)完整，由此成功制備了心臟全器官脫細(xì)胞支架。該團(tuán)隊在此基礎(chǔ)上，將原代大鼠心肌細(xì)胞作為種子細(xì)胞，通過主動脈灌注和多點注射將細(xì)胞種植在脫細(xì)胞支架上。培養(yǎng)4 d后，再細(xì)胞化的人工心臟開始出現(xiàn)搏動，8 d后即能實現(xiàn)初步的泵血功能-相當(dāng)于成年大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)的2%或人類胎兒（約4個月）左心室射血分?jǐn)?shù)的25%。此實驗的成功為此后器官再造的探索注入了一針強(qiáng)心劑，之后諸多全器官再造的實驗如雨后春筍般涌現(xiàn)出來。2010年，Wainwright等［31］在Ott團(tuán)隊的基礎(chǔ)上改進(jìn)了心臟全器官脫細(xì)胞的洗脫方法，為脫細(xì)胞基質(zhì)的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2011年，Akhyari等［32］將自動控制系統(tǒng)引入全器官脫細(xì)胞，實現(xiàn)了時間、溫度等條件的精確控制，大大提高了脫細(xì)胞的效率和穩(wěn)定性。2012年，Patel等［33］分析了脫細(xì)胞基質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)、幾何構(gòu)成、組成成分和血管結(jié)構(gòu)，并開始探索全器官脫細(xì)胞基質(zhì)對干細(xì)胞的影響。他將人骨髓干細(xì)胞作為種子細(xì)胞種植于心臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)中，結(jié)果表明，脫細(xì)胞基質(zhì)可以促進(jìn)干細(xì)胞的黏附、排列和生長分化。鑒于干細(xì)胞在器官再造方法的巨大優(yōu)勢，2013年，Lu等［34］進(jìn)一步將人iPS細(xì)胞種植于全器官脫細(xì)胞基質(zhì)中，構(gòu)建出具有一定電生理特性和搏動功能的心臟，進(jìn)一步發(fā)展了脫細(xì)胞基質(zhì)在干細(xì)胞治療方面的應(yīng)用。

雖然上述研究取得了一些令人鼓舞的結(jié)果，但如今再造心臟的功能水平還與天然心臟有著不小的差距，要將人工心臟應(yīng)用于臨床，我們還有很長的路需要探索。近年來，導(dǎo)電納米材料成為組織工程領(lǐng)域炙手可熱的明星，其憑借納米級的尺徑、良好的機(jī)械特性與優(yōu)異的導(dǎo)電特性在與脫細(xì)胞基質(zhì)結(jié)合后將有廣闊的應(yīng)用前景。2014年，Shevach等［35］就將人大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)與導(dǎo)電納米材料（納米金顆粒）結(jié)合，用于心肌細(xì)胞的培養(yǎng)。結(jié)果表明，納米金顆粒不僅增強(qiáng)了脫細(xì)胞基質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度，更促進(jìn)了心肌細(xì)胞在脫細(xì)胞基質(zhì)上的生長以及電化學(xué)偶聯(lián)的發(fā)育成熟。脫細(xì)胞基質(zhì)材料與納米材料的結(jié)合有望成為未來器官再造的新方向，為脫細(xì)胞基質(zhì)的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4　結(jié)語

心臟脫細(xì)胞基質(zhì)材料是近年來新興的生物材料，它擁有極低的致敏性并且保留了除細(xì)胞成分以外的幾乎所有生物活性成分和完整的三維結(jié)構(gòu)，因此成為組織工程領(lǐng)域的研究熱點。從2008年Ott等成功制備出心臟脫細(xì)胞基質(zhì)至今，脫細(xì)胞方法一直在不斷改進(jìn)，目前制備的效率和質(zhì)量較前都有了較大提高，而更加精確可控的方法也在探索中。心臟脫細(xì)胞支架材料在心肌組織工程領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，它可與種子細(xì)胞共培養(yǎng)后作為心肌補(bǔ)片修復(fù)損傷心肌，也可作為可注射水凝膠攜帶/不攜帶種子細(xì)胞用于心肌梗死治療，在全器官再造研究中更是扮演著重要的角色。目前作為工程化心肌組織，多項研究表明，脫細(xì)胞基質(zhì)片層/水凝膠在心肌梗死治療中可促進(jìn)心肌的修復(fù)及愈合、血管的再生、干細(xì)胞向心肌的分化。可注射性水凝膠材料由于易于操作、安全性高而成為今后臨床應(yīng)用的重要方向，而注射方式的選擇優(yōu)化、種子細(xì)胞的選取、脫細(xì)胞基質(zhì)材料的改良都將成為之后研究的重點。在全器官再造的研究中，研究人員已經(jīng)利用心臟脫細(xì)胞基質(zhì)成功再造出人工心臟，然而，其功能性距臨床需要有一定差距，許多問題還有待解決，如脫細(xì)胞基質(zhì)材料的制備及功能優(yōu)化、種子細(xì)胞的選擇和植入方式、再細(xì)胞化的培養(yǎng)方法等。目前已有研究人員利用導(dǎo)電納米材料改性脫細(xì)胞基質(zhì)，并證明了該材料對心肌細(xì)胞電生理成熟的促進(jìn)作用。今后研究的重點仍將放在材料改良與細(xì)胞培養(yǎng)等各方面條件的優(yōu)化上，以期得到更接近天然心臟的再造器官，為其在臨床器官移植或離體藥學(xué)實驗等方向的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Heart decellularized matrix application in cardiac tissue engineering

BAI Rui1， LIU Huiliang2
1Chinese PLA General Hospital/Chinese PLA Medical School， Beijing 100853， China；2Department of Cardiology， General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces， Beijing 100039， China
Corresponding author: LIU Huiliang. Email: rubywhite333@gmail.com

In recent years， heart decellularized matrix has become attractive for its hypoallergenic and native scaffolds with intact 3D anatomical architecture. It shows broad application prospects in the repair or replace of necrotic myocardial and organ engineering. In this review， we focus on the study of heart decellularized matrix in treatment of myocardial infarction and organ engineering，conduct a systematic review from the preparation， testing and application of heart decellularized matrix， and discuss the direction and application way of this material in the future.

heart decellularized matrix； myocardiac tissue engineering； myocardial infarction； organ regeneration

R 318.08

A

2095-5227（2015）07-0755-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.07.030

2015-01-27

全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項目（13QNP147）

Supported by the Medical Science and Technique Training Foundation for Youths of the Chinese People's Liberation Army （13QNP147）

白睿，女，在讀博士，醫(yī)師。研究方向：心血管疾病。Email: 467001365@qq.com

劉惠亮，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師。Email: rubywhite333@gmail.com