周冬青 劉成永△ 王 驥 王春穎 張克球 劉加彬 黃海濱 候遠(yuǎn)沛 成 松 王 鑫

(1江蘇省徐州市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科,2肝炎科 徐州 221004)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)試劑盒檢測(cè)石蠟包埋肝組織中乙型肝炎病毒(HBV)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)

周冬青1劉成永1△王 驥2王春穎2張克球2劉加彬2黃海濱2候遠(yuǎn)沛1成 松1王 鑫1

(1江蘇省徐州市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科,2肝炎科 徐州 221004)

目的 建立一種檢測(cè)石蠟包埋的肝組織中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的新方法,并探討其應(yīng)用價(jià)值和臨床意義。方法 提取30例慢性HBV感染患者的石蠟包埋肝組織中的DNA,采用質(zhì)粒安全ATP依賴性DNA酶(plasmid-safe ATP-dependent DNase,PSAD)消化,去除非cccDNA后,加入引物及Bst DNA酶進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),將檢測(cè)結(jié)果與臨床實(shí)驗(yàn)室資料結(jié)合并進(jìn)行分析,以判斷其臨床應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果 30例HBV感染患者中,有17例HBV cccDNA陽(yáng)性,陽(yáng)性檢測(cè)率56.67%。其中肝癌5例、肝硬化4例、重型乙型肝炎5例、慢性乙型肝炎(輕-中度)3例。提示肝組織HBV cccDNA陽(yáng)性可能與疾病進(jìn)展密切相關(guān),與血清HBV cccDNA陽(yáng)性有一定的相關(guān)性,與乙型肝炎病毒血清免疫標(biāo)志物以及肝功能狀況無(wú)明顯相關(guān)。結(jié)論 LAMP法能檢測(cè)到石蠟包埋肝組織中的HBV cccDNA,結(jié)合臨床實(shí)驗(yàn)室資料,對(duì)判斷抗病毒藥物療效及研究乙型肝炎致病機(jī)制具有一定的意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP); 乙型肝炎病毒(HBV); 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)

共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是乙型肝炎病毒(chronic hepatitis B virus,HBV)轉(zhuǎn)錄的模板,也是HBV持續(xù)感染的重要因素[1]。在感染和抗病毒藥物治療過(guò)程中,HBV cccDNA在肝細(xì)胞中穩(wěn)定存在[2],盡管cccDNA是致病的關(guān)鍵因素,但難以明確其在肝細(xì)胞中存在的機(jī)制[3]。研究HBV cccDNA的障礙是肝活檢組織不易得(肝活檢屬于有創(chuàng)性檢查),加之目前的檢測(cè)方法尚不完善(國(guó)內(nèi)尚無(wú)正式批準(zhǔn)用于臨床的檢測(cè)試劑)。本研究試圖利用病理科剩余的石蠟包埋肝活檢標(biāo)本,建立一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的新型HBV cccDNA檢測(cè)方法,以達(dá)到節(jié)約成本、減輕患者痛苦(患者不需要再次進(jìn)行肝活檢)的目的,從而為診斷及治療提供參考。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的恒溫?cái)U(kuò)增方法,能在60～65 ℃下、30～60 min內(nèi)將2～3拷貝的靶核苷酸擴(kuò)增到1×109。本研究收集30例慢性HBV感染患者的病理科常規(guī)檢測(cè)剩余的石蠟包埋肝組織,以3例非HBV感染者作為陰性對(duì)照,使用LAMP法檢測(cè)HBV cccDNA,并將檢測(cè)結(jié)果與臨床實(shí)驗(yàn)室資料相結(jié)合,進(jìn)行回顧性研究,探討LAMP在石蠟包埋肝組織HBV cccDNA檢測(cè)中的應(yīng)用及臨床意義。

材 料 和 方 法

樣本來(lái)源 33例石蠟包埋肝組織來(lái)源于2012年至2014年徐州市傳染病醫(yī)院肝炎科就診患者,其中慢性HBV感染者30例,1例酒精肝硬化患者和2例乙肝免疫標(biāo)志物全陰的丙型肝炎患者作為陰性對(duì)照。參考《2010年病毒性肝炎防治指南》[4],30例慢性HBV感染者診斷明確,其中肝癌8例,肝硬化10例,慢性乙型肝炎9例,表面抗原攜帶者3例;男性24例,女性6 例,年齡28～65歲,平均年齡46.5歲。

儀器及試劑 石蠟切片機(jī)及切片刀(德國(guó)萊卡公司)、1.5 mL離心管、移液槍、一次性槍頭、快速石蠟組織DNA提取試劑盒(北京天恩澤生物公司)、質(zhì)粒安全ATP依賴性DNA酶(plasmid-saft ATP-dependent DNace,PSAD)試劑盒(美國(guó)Epicentre公司)、LAMP通用型試劑盒(日本榮研化學(xué)株式會(huì)社)、金屬浴、HBV DNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(廈門安普利公司)LAMP引物由上海生工合成。

石蠟包埋肝組織中DNA的抽提 切取 5～8片肝組織石蠟切片(厚度6 μm),放入1.5 mL的EP管中,使用快速石蠟包埋組織DNA提取試劑盒抽提肝組織中的DNA,具體操作步驟按說(shuō)明書進(jìn)行,主要包括組織的裂解、吸附柱吸附DNA、洗滌純化及洗脫,抽提的DNA分裝后于-20 ℃保存。

PSAD純化cccDNA 為了將cccDNA與rcDNA和單鏈DNA分離,采用酶切法對(duì)抽提產(chǎn)物進(jìn)行純化。由于cccDNA對(duì)PSAD具有抵抗作用,采用PSAD去除非cccDNA,而保留cccDNA。PSAD試劑盒的主要操作方法:取10×緩沖液 2.2 μL、ATP 0.8 μL、PSAD 0.2 μL (2 U)加入6.8 μL抽提的DNA中,使總體積為10 μL,37 ℃下30 min去除非cccDNA,70 ℃下10 min滅活PSAD,終止反應(yīng)。

LAMP法擴(kuò)增HBV cccDNA 采用LAMP法擴(kuò)增HBV cccDNA,所用的5條引物是針對(duì)HBV DNA與HBV cccDNA存在結(jié)構(gòu)差異的6個(gè)區(qū)段(F1、F2、F3、B1、B2、B3)而設(shè)計(jì)的4條嵌合引物(FIP、BIP、F3、B3),以及在B1區(qū)段與B2區(qū)段之間導(dǎo)入1條具有互補(bǔ)序列的環(huán)狀引物L(fēng)B,以增加DNA合成的起點(diǎn)(通過(guò)應(yīng)用環(huán)引物,所有含環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單鏈都能用作擴(kuò)增起點(diǎn))。采用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增DNA。LAMP法以特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)在1 h內(nèi)能擴(kuò)增出1×109靶序列拷貝[5]。嚴(yán)格按照LAMP試劑盒說(shuō)明書操作,取2×緩沖液[含DNTP、Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween 20、Betaine混合液]、稀釋后的5條引物、BstDNA聚合酶、經(jīng)PSAD純化的DNA及雙蒸水,總體積為30 μL,充分混勻,置于金屬浴或?qū)崟r(shí)濁度儀中,63 ℃下30～60 min擴(kuò)增DNA,80 ℃下5 min滅活Bst DNA聚合酶,終止反應(yīng)。

結(jié)果判定 擴(kuò)增結(jié)束后將檢測(cè)樣本與陽(yáng)性對(duì)照一同放在明亮光線下進(jìn)行觀察,混濁為陽(yáng)性,透明為陰性;使用實(shí)時(shí)濁度儀根據(jù)濁度變化進(jìn)行定量。

結(jié) 果

30例慢性HBV感染患者中有17例HBV cccDNA陽(yáng)性,占總樣本的56.67%,其中肝癌5例、肝硬化4例、重型乙型肝炎5例、慢性乙型肝炎(輕至中度)3例;5例乙型肝炎重型患者均為陽(yáng)性,8例肝癌患者中有5例為陽(yáng)性,而3例表面抗原攜帶者均為陰性,提示肝組織HBV cccDNA陽(yáng)性可能與病情進(jìn)展密切相關(guān)。

17例HBV cccDNA陽(yáng)性患者中血清HBV DNA陽(yáng)性者有10例(陽(yáng)性率58.8%)。血清HBV DNA陽(yáng)性者HBV cccDNA陽(yáng)性機(jī)率高于血清HBV DNA陰性者,提示肝組織HBV cccDNA陽(yáng)性與血清HBV cccDNA陽(yáng)性可能有一定的相關(guān)性。然而,另有40%患者雖然血清HBV cccDNA陰性,但其體內(nèi)仍然存在HBV cccDNA。

17例HBV cccDNA陽(yáng)性患者中HBsAg、HBeAg、HBcAb均為陽(yáng)性者有8例,所有陽(yáng)性患者均為HBsAg陽(yáng)性,而肝功能異?；颊哂?例,提示肝組織HBV cccDNA陽(yáng)性可能與HBsAg密切相關(guān),而與HBeAg、HBcAb以及肝功能狀況無(wú)明顯相關(guān)性。

陽(yáng)性對(duì)照HBV cccDNA檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,陰性對(duì)照均為陰性。

討 論

LAMP法能檢測(cè)到石蠟包埋肝組織中的HBV cccDNA,結(jié)合臨床實(shí)驗(yàn)室資料進(jìn)行分析,對(duì)判斷抗病毒藥物療效及研究乙型肝炎致病機(jī)制具有一定的意義。

近年來(lái)HBV cccDNA逐漸成為研究的熱點(diǎn),但是目前對(duì)于HBV cccDNA的研究和開(kāi)發(fā)尚屬初步階段。檢測(cè)技術(shù)難度較大;前期研究主要集中于細(xì)胞模型和肝臟模型,不能滿足臨床檢驗(yàn)的需求;而現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的靈敏度不高,檢測(cè)低限為1×104拷貝/mL;部分研究機(jī)構(gòu)和學(xué)者對(duì)檢測(cè)技術(shù)的特異性認(rèn)識(shí)不足。而cccDNA的檢測(cè)又有許多難點(diǎn)問(wèn)題尚未解決,多種同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、rcDNA、ssDNA、HBV整合的DNA),必須將cccDNA與其他DNA有效分離,才能提高檢測(cè)的特異性。由于細(xì)胞內(nèi)cccDNA含量較低,僅為5～60拷貝/細(xì)胞,必須提高敏感性才能達(dá)到檢測(cè)的目的,為進(jìn)一步完善檢測(cè)技術(shù)并解決難點(diǎn)問(wèn)題,提高HBV cccDNA應(yīng)用價(jià)值及發(fā)展前景,我們收集病理科常規(guī)檢測(cè)剩余的石蠟包埋肝組織并進(jìn)行核酸提取,利用PSAD 分離純化cccDNA,以提高檢測(cè)的特異性。為了進(jìn)一步提高檢測(cè)的特異性及敏感性,我們根據(jù)HBV cccDNA與rcDNA結(jié)構(gòu)上的差異,利用環(huán)介導(dǎo)引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)外引物、1對(duì)內(nèi)引物和1條環(huán)狀引物,并利用Bst DNA聚合酶(該酶特異性較高,擴(kuò)增效率也較高)對(duì)cccDNA進(jìn)行LAMP。Notomi等[6]明確指出LAMP法對(duì)于擴(kuò)增靶序列具有高度的敏感性。鑒于LAMP法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn),而且無(wú)需PCR儀器,只需一臺(tái)恒溫水浴箱或恒溫金屬浴,15 min至1 h即可成擴(kuò)增,從提取DNA 到擴(kuò)增結(jié)束,整個(gè)過(guò)程3 h內(nèi)即可完成,擴(kuò)增產(chǎn)物量大,適合簡(jiǎn)易型檢測(cè)[7-10],可以在基層單位推廣使用。

目前HBV cccDNA的檢測(cè)方法有以下幾種:(1)選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR):根據(jù)HBV DNA與HBV cccDNA結(jié)構(gòu)上的差異,通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)特殊的跨雙缺口引物,選擇性擴(kuò)增cccDNA,松弛環(huán)狀的rcDNA則不被擴(kuò)增;但可能由于PCR產(chǎn)物自身退火而導(dǎo)致失誤。(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR[11]:與定性方法相比較,其增加了與cccDNA負(fù)鏈(rcDNA負(fù)鏈缺口下游)互補(bǔ)的熒光探針,使cccDNA能夠檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)而rcDNA則不能被檢測(cè),但同樣存在PCR產(chǎn)物自身退火而引起松弛環(huán)狀的(rcDNA)被擴(kuò)增的現(xiàn)象,且在HBV cccDNA>1×108拷貝/mL時(shí)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。(3)侵入探針?lè)?使用侵入探針和引物探針,通過(guò)裂解酶特異性切割5′端堿基片段使之與熒光共振能量轉(zhuǎn)移盒結(jié)合,裂解酶再切割熒光共振能量轉(zhuǎn)移盒上熒光基團(tuán)的短臂,發(fā)出熒光信號(hào)。特點(diǎn)是一個(gè)模板可重復(fù)使用,結(jié)合-裂解-結(jié)合-裂解,循環(huán)一次產(chǎn)生一次信號(hào),呈線性信號(hào)放大。優(yōu)點(diǎn)是特異性較強(qiáng),缺點(diǎn)是敏感性較差,低于1×104拷貝/mL無(wú)法檢測(cè)。(4)滾環(huán)擴(kuò)增聯(lián)合熒光定量擴(kuò)增法[12]:有學(xué)者提出用phi29酶(只擴(kuò)增環(huán)狀DNA的一種酶)來(lái)擴(kuò)增環(huán)狀的cccDNA,然后用熒光定量來(lái)檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)是特異性、敏感性均較高;由于滾環(huán)擴(kuò)增是在恒溫的狀態(tài)下進(jìn)行16～18 h的擴(kuò)增,因此耗時(shí)較長(zhǎng),且phi29酶的價(jià)格亦較昂貴,用于臨床可能會(huì)增加患者的負(fù)擔(dān)。(5)原位滾環(huán)擴(kuò)增法:為使擴(kuò)增的HBV cccDNA能夠直觀可見(jiàn),石蠟包埋的肝組織切片用PSAD消化后,再用原位滾環(huán)擴(kuò)增聯(lián)合原位PCR的方法檢測(cè)肝組織中的HBV cccDNA[13]。此法雖然證實(shí)了肝組織中確實(shí)存在HBV cccDNA,具有直觀、可靠、形象的優(yōu)點(diǎn),但只能定性和相對(duì)定量,檢測(cè)結(jié)果不能達(dá)到量化標(biāo)準(zhǔn),因此精確度有限,而且原位滾環(huán)擴(kuò)增對(duì)技術(shù)要求過(guò)高,且操作繁瑣,直接用于臨床的難度較大。以上各種擴(kuò)增技術(shù)需要專門的PCR儀或者原位PCR儀,本研究所用的LAMP試劑盒檢測(cè)HBV cccDNA的方法與之相比,操作簡(jiǎn)單,省時(shí)省力,而且不需要專門的PCR儀器,使用LAMP實(shí)時(shí)濁度儀還可以達(dá)到定量的目的,加入鈣黃綠素,通過(guò)熒光可以使檢測(cè)結(jié)果的目視效果更清晰。

本研究發(fā)現(xiàn)17例HBV cccDNA陽(yáng)性患者中有5例乙型肝炎重型患者,這一方面說(shuō)明肝組織大量壞死可能導(dǎo)致肝細(xì)胞釋放HBV cccDNA增多,另一方面也說(shuō)明重型乙型肝炎患者體內(nèi)HBV DNA復(fù)制活躍,導(dǎo)致進(jìn)入肝細(xì)胞核的HBV DNA增多,形成的HBV cccDNA數(shù)量增多,因?yàn)镠BV cccDNA是HBV DNA復(fù)制的間接模板,又進(jìn)一步促成HBV DNA 復(fù)制增多,導(dǎo)致乙型肝炎病毒數(shù)量增加,進(jìn)一步加重對(duì)肝臟的損傷。8例肝癌患者中5例為HBV cccDNA陽(yáng)性,10例肝硬化患者中4例為HBV cccDNA陽(yáng)性,提示HBV cccDNA陽(yáng)性可能與疾病進(jìn)展密切相關(guān),其在“乙型肝炎-肝硬化-肝癌”進(jìn)展中發(fā)揮了重要的作用,同時(shí)也說(shuō)明HBV cccDNA 是乙型肝炎持續(xù)性感染過(guò)程中的重要因素。17例HBV cccDNA陽(yáng)性患者中10例血清HBV cccDNA為陽(yáng)性,另有7例患者(40%)雖然血清HBV cccDNA為陰性,但患者肝組織HBV cccDNA檢測(cè)為陽(yáng)性,說(shuō)明其體內(nèi)仍然存在HBV cccDNA,這一方面可能與HBV DNA變異有關(guān),另一方面可能與患者應(yīng)用抗病毒藥物有關(guān)。目前的抗病毒藥物主要針對(duì)HBV DNA,對(duì)于HBV cccDNA作用有限,只能通過(guò)間接減少進(jìn)入胞核內(nèi)的HBV DNA使HBV cccDNA逐漸耗竭,當(dāng)抗病毒藥物應(yīng)用時(shí)間較短時(shí),外周血HBV DNA下降較為明顯,而肝組織HBV cccDNA下降相對(duì)緩慢。3例表面抗原攜帶者均為陰性,一方面說(shuō)明患者免疫耐受,另一方面說(shuō)明患者體內(nèi)HBV DNA復(fù)制率較低,而這種復(fù)制率低可能恰恰是因?yàn)楦谓M織內(nèi)HBV cccDNA含量低,HBV DNA由于間接模板減少而導(dǎo)致復(fù)制力下降。趙克開(kāi)等[14]認(rèn)為即使慢性乙型肝炎患者血清HBsAg清除,由于肝組織中少量HBV cccDNA 的存在,部分乙型肝炎仍有復(fù)發(fā)的可能,因此建立一種敏感性和特異性較好的簡(jiǎn)便的肝組織HBV cccDNA檢測(cè)方法,對(duì)于評(píng)價(jià)乙型肝炎抗病毒藥物療效、判斷病情及預(yù)后具有一定的意義。

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A detection method of the loop-medidated isothermal amplification (LAMP) kit for hepatitis B virus (HBV) covalently closed circular DNA (cccDNA) in paraffin embedded liver tissues established

ZHOU Dong-qing1, LIU Cheng-yong1△, WANG Ji2, WANG Chun-ying2, ZHANG Ke-qiu2, LIU Jia-bin2, HUANG Hai-bin2, HOU Yuan-pei1, CHENG Song1, WANG Xin1

(1ClinicalLaboratory,2DepartmentofHepatitis,XuzhouInfectiousDiseaseHospital,Xuzhou221004,JiangsuProvince,China)

Objective To establish a novel method for detecting hepatitis B virus (HBV) covalently closed circular DNA (cccDNA) of paraffin embedded liver tissues,and to discuss its application value and clinical significance. Methods The extraction DNA of 30 patients with chronic HBV infection in paraffin embedded liver tissues was digested by plasmid-safe ATP-dependent DNase (PSAD).Non cccDNA was removed, and then the necessary primers and Bst DNA polymerase were added together for loop mediated isothermal amplification (LAMP).The detection results combined with clinical laboratory data were analyzed to estimated its clinical application valus. Results Among the 30 HBV infected patients,17 cases were detected as HBV cccDNA positive with the positive detection rate of 56.67%,of which 5 cases were liver cancer,4 cases were cirrhosis,5 cases were severe chronic hepatitis B,and 3 cases were mild to moderate charonic hepatitis B.It revealed that positive HBV cccDNA might have a close link with the progress of the disease,also had a certain correlation with the serum HBV DNA loading,but had no obvious correlation with HBV serum markers and liver function.Conclusions LAMP detection method can indicate HBV cccDNA in the paraffin embedding liver tissue,which combined with clinical laboratory data has a certain significance in judging the antiviral efficacy and researching pathogenic mechanism of HBV.

loop-mediated isothermal amplification (LAMP); hepatitis B virus (HBV); covalently closed circular DNA (cccDNA)

R 373.2+1

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.02.018

2014-10-17;編輯:段佳)

△Corresponding author E-mail:crblt@126.com