劉 照 戴新華 李孟婉 李紅梅 暴海霞

(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京100029)

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質(zhì)量平衡法對(duì)氨基酸純度定值的研究進(jìn)展*

劉 照 戴新華 李孟婉 李紅梅 暴海霞

(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京100029)

氨基酸純度定值方法主要有質(zhì)量平衡法、定量核磁法、滴定法和差示掃描量熱法等。質(zhì)量平衡法是指測(cè)量出氨基酸中的所有雜質(zhì)，然后從100%中減去這些雜質(zhì)(與主成分結(jié)構(gòu)類(lèi)似物雜質(zhì)、水分、揮發(fā)性雜質(zhì)、無(wú)機(jī)雜質(zhì))而得到其純度值。質(zhì)量平衡法適用于所有的有機(jī)純物質(zhì)定值，而且不確定度相對(duì)較小，目前物質(zhì)量咨詢(xún)委員會(huì)有機(jī)工作組把該方法作為有機(jī)純物質(zhì)純度定值的基準(zhǔn)方法。本文綜述了采用質(zhì)量平衡法對(duì)氨基酸純品進(jìn)行純度定值時(shí)，對(duì)氨基酸中各類(lèi)雜質(zhì)檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展。

純度定值；質(zhì)量平衡法；氨基酸；雜質(zhì)

0 引言

氨基酸是合成蛋白質(zhì)的重要原料，對(duì)于促進(jìn)生長(zhǎng)，進(jìn)行正常代謝、維持生命活動(dòng)等具有重要意義。如果人體缺乏或減少其中某一種，人體的正常生命代謝就會(huì)發(fā)生障礙，甚至導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生或生命活動(dòng)終止。例如：甲硫氨酸幫助分解脂肪，能預(yù)防脂肪肝，心血管疾病和腎臟疾病的發(fā)生，防止肌肉軟弱無(wú)力，將有害物質(zhì)如鉛等重金屬除去，治療風(fēng)濕熱和懷孕時(shí)的毒血癥；色氨酸促進(jìn)睡眠，減少對(duì)疼痛的敏感度，緩解偏頭痛，緩和焦躁及緊張情緒[1-3]。由此可見(jiàn)，氨基酸在人體生命活動(dòng)中非常需要。由于氨基酸的分析檢測(cè)在各個(gè)領(lǐng)域[3](如食品、飼料添加劑、化妝品、臨床醫(yī)學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等)都起著極其重要的作用，世界各國(guó)都高度重視對(duì)氨基酸分析方法的研究。而氨基酸純物質(zhì)中雜質(zhì)定性和定量準(zhǔn)確與否將直接影響其純度值，從而進(jìn)一步影響基體中該類(lèi)物質(zhì)的測(cè)量結(jié)果。因此，實(shí)現(xiàn)氨基酸中微量和痕量雜質(zhì)的準(zhǔn)確定性和定量是采用質(zhì)量平衡法對(duì)氨基酸純物質(zhì)純度測(cè)量的難題，也是制約我國(guó)氨基酸高質(zhì)量純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)的主要技術(shù)瓶頸。針對(duì)質(zhì)量平衡法將氨基酸中雜質(zhì)分為與主成分結(jié)構(gòu)類(lèi)似雜質(zhì)、易揮發(fā)性雜質(zhì)VOCs、水分和難揮發(fā)性無(wú)機(jī)雜質(zhì)四大類(lèi)，分別對(duì)這四類(lèi)雜質(zhì)的測(cè)量技術(shù)展開(kāi)討論。

1 氨基酸純度定值方法

純物質(zhì)是化學(xué)成分量分析的基礎(chǔ)，其純度值的準(zhǔn)確性決定國(guó)家相關(guān)領(lǐng)域的測(cè)量水平[4-7]。如果純物質(zhì)的純度或其中的雜質(zhì)得不到準(zhǔn)確定值，那么由此產(chǎn)生的國(guó)家最高級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值就會(huì)出現(xiàn)偏差，從而對(duì)整個(gè)國(guó)家化學(xué)成分量測(cè)量的量值傳遞和測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生極其嚴(yán)重的影響。目前分析有機(jī)純品純度的方法主要有直接法和間接法。氨基酸類(lèi)純度定值技術(shù)目前主要有質(zhì)量平衡法、定量核磁法、滴定法和差示掃描量熱法。

1.1 定量核磁法

定量核磁共振技術(shù)[8-10]作為一種日益成熟的分析方法，具有傳統(tǒng)方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)：樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、測(cè)定快速準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)、不破壞樣品等，現(xiàn)已在化學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)以及軍事領(lǐng)域得到應(yīng)用，目前常作為有機(jī)純物質(zhì)純度定值的方法之一。

核磁共振法測(cè)定氨基酸純度，只需要得到無(wú)干擾的定量峰，以及合適的、已知純度的一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為定量用內(nèi)標(biāo)，采用適當(dāng)?shù)碾軇┤芙鈽悠泛蛢?nèi)標(biāo)物．通過(guò)定量峰面積的測(cè)量，就可計(jì)算得到樣品的純度值。閆秀云等[9]利用1H NMR內(nèi)標(biāo)法對(duì)四種化合物進(jìn)行了純度分析，其結(jié)果與氣相色譜法(GC)對(duì)比有較好的一致性。Szabolcs等[10]利用1H NMR、13C NMR將標(biāo)準(zhǔn)的肝素樣品和受污染的肝素譜圖進(jìn)行對(duì)比，可以明顯看到污染的肝素中存在雜質(zhì)，通過(guò)扣除雜質(zhì)干擾峰，可算出樣品的純度值。

1.2 滴定法

滴定法主要依賴(lài)滴定劑的官能團(tuán)與主組分官能團(tuán)進(jìn)行顯色反應(yīng)。氨基酸中含有氨基和羧基官能團(tuán)，能與茚三酮反應(yīng)生成有色物質(zhì)。劉飛飛等[11]利用茚三酮比色法測(cè)定了賴(lài)氨酸含量。該方法中，由于存在與主成分結(jié)構(gòu)類(lèi)似的雜質(zhì)氨基酸，也將與茚三酮反應(yīng)生成有色物質(zhì)，因此測(cè)量結(jié)果會(huì)產(chǎn)生偏差[6]。

1.3 差示掃描量熱法

差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)是一種熱分析技術(shù)，在一定的程序升溫條件下，測(cè)量樣品和參比物的功率差與溫度的關(guān)系，適用于加熱過(guò)程中不發(fā)生熱分解、不與外界產(chǎn)生熱效應(yīng)的有機(jī)純物質(zhì)的純度分析。Mathkar等[12]采用DSC法測(cè)定了多種有機(jī)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度。

1.4 質(zhì)量平衡法

質(zhì)量平衡法又叫雜質(zhì)扣除法[6,12]，即從100%中減去與主成分結(jié)構(gòu)類(lèi)似雜質(zhì)、水分、殘留溶劑和不揮發(fā)性雜質(zhì)。在各類(lèi)雜質(zhì)測(cè)定方面，質(zhì)量平衡法克服了由于不同物質(zhì)理化性質(zhì)不同而造成的響應(yīng)值的差異，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定雜質(zhì)含量的缺點(diǎn)。利用不同物質(zhì)的各方面性質(zhì)的差異，實(shí)現(xiàn)氨基酸中主成分與雜質(zhì)的分離，借助質(zhì)譜、卡爾費(fèi)休等分析技術(shù)對(duì)氨基酸中雜質(zhì)含量進(jìn)行定性定量。將各種分離和分析方法進(jìn)行不同組合和聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)氨基酸中雜質(zhì)含量的測(cè)定。

2 質(zhì)量平衡法對(duì)氨基酸純度定值中各類(lèi)雜質(zhì)的測(cè)量方法

2.1 與主成分結(jié)構(gòu)類(lèi)似有機(jī)雜質(zhì)的分析技術(shù)

目前，氨基酸的生產(chǎn)方法主要是發(fā)酵法[13-16]，因此，氨基酸中的結(jié)構(gòu)類(lèi)似雜質(zhì)也主要是一些含氨基和羧基的氨基酸類(lèi)有機(jī)物[16]。為了對(duì)氨基酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物雜質(zhì)進(jìn)行定量，首先應(yīng)采取合適的分離方法進(jìn)行雜質(zhì)與主成分的分離。關(guān)于20種氨基酸分離技術(shù)，報(bào)道的主要是色譜法及其聯(lián)用技術(shù)[17-38]。利用色譜法分離氨基酸雜質(zhì)，要求檢測(cè)器對(duì)所有雜質(zhì)都有響應(yīng)信號(hào)。

2.1.1衍生法

在20種基本氨基酸中只有苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸有紫外吸收基團(tuán)，氨基酸不易揮發(fā)，無(wú)法直接利用氣相色譜分離，因此當(dāng)采用HPLC-UV或氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)分析氨基酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物雜質(zhì)時(shí)需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，使氨基酸具有揮發(fā)性或紫外吸收。Fiechter等[18]以6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸脂(AQC)作為衍生劑，應(yīng)用超高效液相色譜(UPLC-UV)能在23min內(nèi)分離24種從發(fā)酵沉淀物中提取出來(lái)的游離氨基酸，與普通的液相色譜法相比縮短了分析時(shí)間，提高了分離度。還有文獻(xiàn)報(bào)道用9-芴甲基氯甲酸酯(FMOCCl)[21，25]、乙氧亞甲基丙二酸二乙酯[26]等衍生試劑將氨基酸衍生，從而實(shí)現(xiàn)HPLC-UV同時(shí)分離檢測(cè)多種氨基酸。

氣相色譜法分析氨基酸具有柱效高、分析速度快、易與質(zhì)譜儀聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)。由于氨基酸含有氨基、羧基和羥基等極性基團(tuán)，易利用氨基酸衍生化試劑將其轉(zhuǎn)變?yōu)橐子谄难苌a(chǎn)物，然后選擇適當(dāng)?shù)纳V柱和檢測(cè)器進(jìn)行分離檢測(cè)。Muhammad等[22]利用三氟乙酰丙酮和氯甲酸乙酯兩步衍生法，成功分離19種氨基酸，但該方法衍生條件苛刻，不同氨基酸衍生反應(yīng)速度不同或衍生化試劑也不同，不能采用同一根色譜柱實(shí)現(xiàn)全部氨基酸的測(cè)定，樣品要經(jīng)脫鹽處理，實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣且易帶來(lái)污染。

隨著氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)的快速發(fā)展，一些學(xué)者將其應(yīng)用于氨基酸的分析檢測(cè)，氣質(zhì)聯(lián)用相對(duì)于簡(jiǎn)單的氣相色譜法可以明顯提高對(duì)樣品的檢測(cè)限和靈敏度。Magdalena等[23]利用氯甲酸丙酯進(jìn)行衍生后采用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)，檢出限在3.2～446nmol/L之間。Chen等[24]通過(guò)同樣的試劑衍生，得到比較一致的檢出限(50～250nmol/L)。由于衍生化過(guò)程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，而且會(huì)引入一些副產(chǎn)物，因此，對(duì)于氨基酸純度定值來(lái)說(shuō)，可能將導(dǎo)致定值結(jié)果的偏差。

2.1.2 直接法

氨基酸大部分沒(méi)有紫外吸收，所以直接檢測(cè)氨基酸目前一般采用ELSD[27-29]、CAD[30]、MS[31-38]等檢測(cè)器。20種基本氨基酸中只有亮氨酸和異亮氨酸的分子量相同，目前，氨基酸反相液相色譜法[31-32]均能分開(kāi)亮氨酸與異亮氨酸。由于質(zhì)譜法的特異性，利用HPLC-MS法可以分析在色譜上分離度不好的氨基酸。HPLC-MS法具有較高的靈敏度和選擇性，能夠提供足夠的樣品結(jié)構(gòu)信息，抗干擾性能好，無(wú)須對(duì)樣品進(jìn)行衍生處理，定性定量能力強(qiáng)，有很好的發(fā)展趨勢(shì)。

Dan等[29]利用HPLC-ESLD在25分鐘內(nèi)檢測(cè)了14種氨基酸，檢測(cè)限在20～56mg/L之間。Roberta等[31]利用HPLC/ESI-MSMS非衍生化對(duì)藝術(shù)壁畫(huà)中21種氨基酸含量進(jìn)行了準(zhǔn)確的定量，檢測(cè)限在0.09～56.2μg/g之間。Jia等[16]利用丹酰氯衍生化，用LC-TOF-MS可以同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵食物樣品中23種氨基酸和7種生命必須氨基酸。尤其是串聯(lián)質(zhì)譜具有特征離子提取功能，在檢測(cè)時(shí)對(duì)于氨基酸的分離度要求相對(duì)較低，對(duì)于氨基酸中結(jié)構(gòu)類(lèi)似物雜質(zhì)定性是一種強(qiáng)有力的分析手段。近年來(lái)同位素標(biāo)記法[37-38]應(yīng)用于氨基酸分析發(fā)展快速，使得氨基酸定量越來(lái)越準(zhǔn)確。

在氨基酸純品定值中結(jié)構(gòu)類(lèi)似物雜質(zhì)是最主要的一類(lèi)雜質(zhì)，且大部分為氨基酸類(lèi)物質(zhì)[16，45]。由于每種方法都有其局限性，所以對(duì)于氨基酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物雜質(zhì)的分析，需要多種分析手段進(jìn)行相互確認(rèn)和驗(yàn)證。Megumi等[45]比較了鄰苯二甲醛衍生法(OPA)、AQC衍生法、離子對(duì)反相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(RP-LCMS)分析異亮氨酸、纈氨酸等氨基酸，通過(guò)OPA法優(yōu)越的分離手段，采用RP-LCMS對(duì)氨基酸雜質(zhì)進(jìn)行定性。

2.2 揮發(fā)性雜質(zhì)的分析方法

在有機(jī)純物質(zhì)純度測(cè)量中，通常存在微量殘留溶劑[56]稱(chēng)為揮發(fā)性雜質(zhì)(VOCs)。目前，VOCs的檢測(cè)方法[46-48]有氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、離子遷移譜和質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜法。氣相色譜法作為VOCs的常用分析方法，可以對(duì)微量和痕量組分進(jìn)行定性和定量。檢測(cè)過(guò)程分為：采集氣體樣品、進(jìn)行預(yù)處理、富集、氣相層析分離，再采用適宜的檢測(cè)器(FID、MS等)進(jìn)行檢測(cè)。周宏[46]建立了吹掃捕集-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定飲用水中59種揮發(fā)性有機(jī)物的方法，檢出限為0.004～0.085μg/L，可滿(mǎn)足飲用水中特定有機(jī)分析項(xiàng)目的檢測(cè)要求。Joost等[47]提出了質(zhì)子轉(zhuǎn)移質(zhì)譜法，能夠在線、快速、實(shí)時(shí)地檢測(cè)氣體樣品中的殘留溶劑。許秀艷[48]等總結(jié)了頂空進(jìn)樣法與GC-FID和GC-MS聯(lián)用，比較適用于有機(jī)純物質(zhì)中殘留溶劑的定性和定量，能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)常見(jiàn)的殘留的揮發(fā)性溶劑。

2.3 水分分析方法

對(duì)于純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，水分含量的測(cè)量是非常重要的。目前應(yīng)用廣泛的水分含量測(cè)定的方法[49-53]主要有熱重和卡爾費(fèi)休法。熱重分析法要求加熱過(guò)程中樣品不分解。另外，有些結(jié)晶水不一定能完全逸出，樣品中殘留的揮發(fā)性溶劑，也可能在加熱過(guò)程中逸出，影響水分含量的測(cè)定。Yazgan等[49]采用熱重-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)了熱失重過(guò)程中逸出的水分、降解產(chǎn)物和易揮發(fā)性物質(zhì)。

卡爾費(fèi)休法包括庫(kù)侖法和容量法，是國(guó)際公認(rèn)的測(cè)量純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中水分含量的常用方法，可以測(cè)量固體和液體有機(jī)物和無(wú)機(jī)物中的水分[50]。周劍[51]等考察了環(huán)境濕度、開(kāi)蓋加樣時(shí)間、基線漂移和空白值對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在環(huán)境相對(duì)濕度低于35%，加樣時(shí)間控制在8s以?xún)?nèi)時(shí)，基線漂移比較穩(wěn)定，空白值比較低且穩(wěn)定。王海峰等[52-53]采用庫(kù)侖法、容量法和定量核磁共振法測(cè)定了一系列水分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。庫(kù)侖法與容量法之間的偏差為0.06%，核磁法與庫(kù)侖法之間的偏差為0.50%，不同方法之間測(cè)定結(jié)果的一致性較好。

對(duì)難溶于卡爾費(fèi)休試劑的氨基酸純度樣品，Kestens等[50]研究了加熱汽化庫(kù)侖滴定法。該方法考察了樣品質(zhì)量、載氣種類(lèi)、流速、爐溫對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響，與此同時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)水樣進(jìn)行了測(cè)量驗(yàn)證。結(jié)果表明，最小樣品量大約2mg，惰性氣體種類(lèi)對(duì)測(cè)量結(jié)果影響不明顯，氣體流速50mL/min，爐溫140℃是最優(yōu)條件，與直接加樣的庫(kù)侖法相比，加熱汽化進(jìn)樣法有較好的重現(xiàn)性和更小的不確定度。

2.4 不揮發(fā)性雜質(zhì)的分析方法

有機(jī)純物質(zhì)中無(wú)機(jī)雜質(zhì)含量的測(cè)定[54-57]目前國(guó)際上主要有電感耦合等離子體質(zhì)譜、熱重分析和灼燒殘留等。

電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法是一種新的微量(10-6)、痕量(10-9)和超痕量(10-12)元素分析方法?？蓽y(cè)定元素周期表中大部分元素，低檢出限、寬的動(dòng)態(tài)線性范圍、譜線簡(jiǎn)單、干擾少、分析速度快、可提供同位素分析[54]。Zhang等[55]通過(guò)微波消解能同時(shí)檢測(cè)草莓和藍(lán)莓中18種基本元素，線性范圍為0～1250.0μg/L。戴等[56]在國(guó)際比對(duì)CCQM-K55C中采用ICP-MS測(cè)L-纈氨酸中不揮發(fā)性雜質(zhì)，同時(shí)用熱重分析和灼燒殘留作為驗(yàn)證，結(jié)果相一致。

3 展望

為了研制高水平的氨基酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，需要先建立高準(zhǔn)確度的氨基酸定值方法，保障定值結(jié)果的可靠性和溯源性。本文介紹了質(zhì)量平衡法以及氨基酸純物質(zhì)中四類(lèi)雜質(zhì)的分析方法原理、應(yīng)用實(shí)例和局限性。與其他有機(jī)純物質(zhì)類(lèi)似，氨基酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中雜質(zhì)主要分為與主成分結(jié)構(gòu)類(lèi)似物雜質(zhì)、揮發(fā)性有機(jī)物、難揮發(fā)無(wú)機(jī)雜質(zhì)、水分四類(lèi)。因此，通過(guò)對(duì)這四類(lèi)雜質(zhì)檢測(cè)方法的研究，建立較為完整的氨基酸純度定值技術(shù)體系，為氨基酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供技術(shù)支撐，將對(duì)生物、臨床醫(yī)學(xué)、食品監(jiān)測(cè)和化學(xué)化工等許多領(lǐng)域中氨基酸成分量的準(zhǔn)確測(cè)量提供高準(zhǔn)確度的純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

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10.3969/j.issn.1000-0771.2015.08.02