陳偉潘

摘 要 CRISPR/Cas9系統(tǒng)是新一代的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，已成功應(yīng)用于多種物種，例如，人、鼠、果蠅等。簡(jiǎn)單介紹該技術(shù)在水稻中的研究進(jìn)展。 涉及該系統(tǒng)的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)化方法、突變效率等內(nèi)容。

關(guān)鍵詞 CRISPR/Cas9；水稻；基因編輯

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2015）03--02

基因的準(zhǔn)確、便捷、高效率的編輯技術(shù)一直是生物分子領(lǐng)域有待解決的難題。2013年，在《SCIENCES》上發(fā)表的2篇有關(guān)clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated 9（Cas9）系統(tǒng)進(jìn)行人和鼠基因的定點(diǎn)編輯技術(shù)[1-2]，宣告該定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了重大的突破。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是繼轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）技術(shù)和鋅指核酸酶（ZFN）之后的新一代的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可準(zhǔn)確對(duì)基因進(jìn)行插入或者缺失，從而定點(diǎn)的敲除目標(biāo)基因。自該系統(tǒng)首次在人類和鼠中進(jìn)行基因的定點(diǎn)敲除應(yīng)用成功以來(lái)，該系統(tǒng)也被逐漸應(yīng)用于其他的物種。例如，果蠅、斑馬魚(yú)、線蟲(chóng)等[3-4]。本文主要介紹CRISPR/Cas9在水稻中進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變的研究進(jìn)展。

1 CRISPR/Cas9原理

最新報(bào)道的CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬于Ⅱ型系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含crRNA（CRISPR RNA）、tracr RNA（trans-activating crRNA）、核酸內(nèi)切酶Cas9。Cas9在crRNA與tracr RNA的配合引導(dǎo)下與目標(biāo)序列特異結(jié)合，Cas9的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域HNH和RuvC分別切開(kāi)雙鏈中的一條單鏈，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，并啟動(dòng)細(xì)胞修復(fù)機(jī)制，通過(guò)非同源末端連接產(chǎn)生基于定點(diǎn)突變。其中，crRNA與tracr RNA可以融合為一個(gè)引導(dǎo)RNA（sgRNAs）進(jìn)行使用。其同樣具有和crRNA與tracr RNA配合使用的功能，并且還更方便于載體的構(gòu)建。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中的應(yīng)用

水稻作為具有重大經(jīng)濟(jì)意義生物，是我國(guó)植物分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)。2013年Zhengyan Feng 等[5]將Cas9系統(tǒng)成功應(yīng)用于水稻基因的定點(diǎn)突變，其通過(guò)將原核生物的Cas9的密碼子進(jìn)行偏好性優(yōu)化，并用35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9表達(dá)，且在Cas9碳端添加核定位信號(hào)表達(dá)Cas9。使用OsU6-2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA表達(dá)分別構(gòu)建載體，并用農(nóng)桿菌介相關(guān)導(dǎo)載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織。成功對(duì)水稻基因SPP，YSA，ROC5準(zhǔn)確地進(jìn)行了突變。這是首次報(bào)道了CRISPR/Cas9在水稻基因定點(diǎn)突變中的應(yīng)用。同期Jin Miao等[6]報(bào)道了將Cas9系統(tǒng)成功應(yīng)用于水稻基因CAO1和LAZY1的定點(diǎn)突變，與Zhengyan Feng等報(bào)道的不同的是，其使用Ubi作為Cas9的啟動(dòng)子，使用U3作為 sgRNA和crRNA：tracrRNA的啟動(dòng)子，且sgRNA和 Cas9構(gòu)建在一個(gè)載體上共轉(zhuǎn)化水稻，這系統(tǒng)看起來(lái)具有更高效的突變效果，兩個(gè)基因的突變率分別達(dá)到了83.3%和91.6%。

3 sgRNA的選擇

在水稻的應(yīng)用中，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)使用sgRNA要比crRNA和tracrRNA配合使用的效率更高[6]。Huanbin Zhou等[7]發(fā)現(xiàn)在水稻中具有85 bp尾巴的sgRNA比48 bp的具有更高的突變效率。另外，研究發(fā)現(xiàn)高GC含量的sgRNA具有較高的突變效率，因此，在設(shè)計(jì)sgRNA的時(shí)候，應(yīng)盡可能選擇85 bp尾巴且高GC含量的sgRNA。

4 多基因、大片段突變

在水稻的應(yīng)用中，可以通過(guò)基于Gateway技術(shù)可以構(gòu)建同時(shí)包含兩條或4條sgRNA和Cas9的載體。兩條sgRNA分別用不同的U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，在水稻原生質(zhì)體和愈傷組織中成功使染色體出現(xiàn)大片段的缺失，缺失片段可達(dá)245 kb ，該系統(tǒng)還可以用于同時(shí)一次性突變4個(gè)目標(biāo)基因[7]，多個(gè)基因同時(shí)突變不會(huì)互相影響。

5 CRISPR/Cas9優(yōu)點(diǎn)

CRISPR/Cas9具有構(gòu)建載體簡(jiǎn)單，特異性高，且可快捷實(shí)現(xiàn)多基因甚至大片的敲除，突變位點(diǎn)可以在水稻中穩(wěn)定地按照孟德?tīng)栠z傳定律遺傳，且低脫靶率等優(yōu)點(diǎn)[8]。必將對(duì)水稻的基因功能的研究，以及水稻的育種應(yīng)用產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1]Le Cong，F(xiàn). Ann Ran，David Cox，et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR Cas [J]. Systems Science，2013，339（15）：19-822.

[2]Prashant Mali，Luhan Yang，Kevin M Esvelt et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9[J].Science，2013，339（15）：823-825.

[3]Ari E Friedland，Yonatan B Tzur，Kevin M Esvelt，et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system[J]. Nature Methods，2013，10（8），741-743.

[4]Nannan Chang，Changhong Sun，Lu Gao，et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in Zebrafish embryos[J].Cell Reasearch，2013，23（4）：465-472.

[5]Zhengyan Feng，Botao Zhang，Wona Ding，et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system[J].Cell Rearch，2013，23（10）：1229-1232.

[6]Jin Miao，Dongshu Guo，Jinzhe Zhang，et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas [J].system，2013，23（10）： 1233-1236.

[7]Huanbin Zhou，Bo Liu，Donald P. Weeks，et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice[J].Nucleic Acids Research，2014，42（17）： 1233-1236.

[8]Hui Zhang，Jinshan Zhang，Pengliang Wei，et al. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation[J].Plant Biotechnology Journal，2014，12（6）： 797-807.

（責(zé)任編輯：趙中正）