候文靜　王旺　方銳　沃思宇　張捷　丁亦男

摘 要 目的：克隆紅花低分子量油體蛋白基因L-Oleosin，并進(jìn)行測(cè)序和序列比較分析。方法：參考已完成的紅花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性引物，從野生型紅花種子中提取RNA，以 RT-PCR方法擴(kuò)增L-Oleosin全長(zhǎng)基因，測(cè)序之后，進(jìn)行不同物種同源基因間的系統(tǒng)發(fā)生分析，應(yīng)用Phylip軟件繪制分子進(jìn)化樹(shù)。 結(jié)果：克隆了紅花低分子量油體蛋白基因，系統(tǒng)發(fā)生分析表明，L-Oleosin基因的變異很大，物種間差異明顯。 結(jié)論 進(jìn)行油體蛋白基因相關(guān)功能研究和建立油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)等方面的研究應(yīng)該以同種屬植物或親緣關(guān)系較近的植物之間應(yīng)用為主，基因工程改造和功能驗(yàn)證應(yīng)在本物種上進(jìn)行，然后拓展至近緣物種。

關(guān)鍵詞 紅花油體蛋白；基因克隆；系統(tǒng)發(fā)生分析

中圖分類號(hào)：R284.2；R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2015）03-00-02

紅花（Carthamus tinctorius L.）為菊科紅花屬的植物，含油率高、產(chǎn)量也高，因此成為新興的油料作物，其含亞油酸高達(dá)70%～80%[1]。紅花種子油在醫(yī)藥上常用作抗氧化劑和維生素A和D的穩(wěn)定劑[2]。用紅花油體系統(tǒng)作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白具有生產(chǎn)成本低、易于分離純化、提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)附加值等優(yōu)點(diǎn)[3]。

Oleosin是與油體特異性結(jié)合的一種堿性蛋白質(zhì)，也是油體中發(fā)現(xiàn)最早且含量最高的蛋白質(zhì)，只存在于植物中[4]。Oleosin在被子植物主要存在高分子量和低分子量?jī)煞N同型體[5]，為了探索油體蛋白與紅花含油量的關(guān)系，便于利用基因工程改造提高紅花的含油量，以及利用油體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白，本研究通過(guò)提取野生紅花種子總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA之后，設(shè)計(jì)特異引物克隆了紅花低分子量（L-Oleosin）油體蛋白基因，測(cè)序之后，進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生分析，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 種子與植株

野生紅花種子，來(lái)源于新疆塔城，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒，RT-PCR試劑盒，T載體試劑盒，T4 DNA連接酶，核酸內(nèi)切酶等為大連寶生物公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 紅花種子總RNA提取

取野生型紅花種子置于液氮中，利用RNAiso Plus（大連寶生物工程有限公司）提取紅花種子RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為PCR模板，應(yīng)用自行設(shè)計(jì)的Oleosin基因特異性引物建立反應(yīng)條件進(jìn)行目的基因克隆，提取的RNA-80冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 紅花L-Oleosin基因PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)

引物序列設(shè)計(jì)參考課題組紅花種子轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的參考序列設(shè)計(jì)如下：

Fol上游 5- CCCTTCAAATCCATCGCACCTTCTTCC -3

Rol下游 5- AACGGAGCCTTTATTCACATTCATTAT -3

參照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，將提取的紅花種子總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。經(jīng)優(yōu)化后的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，40 s，55℃，40 s，72℃ 50 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸6 min。

1.5 紅花L-Oleosin基因測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)生分析 PCR擴(kuò)增的目的基因產(chǎn)物回收并純化之后，克隆入pMD18-T載體中。酶切鑒定陽(yáng)性的克隆委托上海英駿測(cè)序公司（Invitrogen）進(jìn)行測(cè)序。

獲得測(cè)序結(jié)果之后，檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已公開(kāi)資料，以BLAST檢索比對(duì)L-Oleosin基因在不同物種間的全長(zhǎng)編碼序列，下載處理之后，利用phylip軟件（3.695）采取鄰接分析的最大似然距離（Maximum Likelihood，ML）法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)而分析紅花L-Oleosin基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花L-Oleosin基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

以紅花種子總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小約750 bp。測(cè)序報(bào)告結(jié)果表明，成功克隆了紅花L-Oleosin基因的全長(zhǎng)編碼序列，基因編碼序列長(zhǎng)度為488 bp，編碼161個(gè)氨基酸。其蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)序列中含有的不同植物油體蛋白均具備的經(jīng)典“脯氨酸結(jié)”一級(jí)結(jié)構(gòu)序列，即PLLVIFSPVLVP，共12個(gè)氨基酸，位于紅花L-Oleosin蛋白氨基酸的第66-77位。

2.2 Phylip軟件繪制的系統(tǒng)發(fā)生分析進(jìn)化樹(shù)

在Phylip軟件包中，依次做SEQBOOT、DNADIST、NEIGHBOR計(jì)算，生成的進(jìn)化樹(shù)結(jié)果見(jiàn)圖1，其中Olesin488為本研究克隆的紅花L-Oleosin基因的全長(zhǎng)編碼序列。

圖1 L-Oleosin基因的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，進(jìn)行油體蛋白基因相關(guān)的功能研究和建立油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)等研究應(yīng)該以同種屬植物或親緣關(guān)系較近的植物之間互相應(yīng)用為主，本研究發(fā)現(xiàn)，紅花油體蛋白的系統(tǒng)發(fā)生與擬南芥等模式植物的親緣關(guān)系較近，因此可以在擬南芥中對(duì)紅花油體蛋白基因進(jìn)行相關(guān)表達(dá)和機(jī)制探索。若對(duì)油體蛋白進(jìn)行基因工程改造和功能驗(yàn)證應(yīng)首先在本物種上進(jìn)行，然后拓展至近緣物種。

參考文獻(xiàn)

[1]楊玉霞，吳衛(wèi)，鄭有良.紅花研究進(jìn)展[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，32（4）： 365–369.

[2]扈曉佳，殷莎，袁婷婷，等.紅花的化學(xué)成分及其藥理活性研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2013，31（3）： 161-168.

[3]趙鋼，王安虎.紅花的資源及藥用價(jià)值[J].中國(guó)野生植物資源，2004，23（3）：24-25.

[4]仇鍵，譚曉風(fēng).植物種子油體及相關(guān)蛋白研究綜述[J].中南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，25（4）：96-100.

[5]TAISS，CHEN MC，PENG C-C，et al. Gene Family of Oleosin Isoforms and Their Structural Stabilization in Sesame Seed 0il Bodies[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2002，66（10）： 2146-2153.

（責(zé)任編輯：劉昀）