劉博　孔婷婷　劉限　高增貴　姚遠(yuǎn)　唐琳　何世道

摘要：前期利用In-Fusion SMARTerTM cDNA Library-Construction Kit已完成玉米紋枯病菌WF-9菌株的全長cDNA文庫，并進(jìn)行EST分析。筆者在此基礎(chǔ)上，將EST片段進(jìn)行聚類拼接，得到一個長944 bp的序列，根據(jù)所得序列開放閱讀框設(shè)計引物，克隆得到玉米紋枯病病菌y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因（GGT）cDNA序列，以生物信息學(xué)方法對其序列進(jìn)行預(yù)測分析，并利用real-time PCR分析GGT在立枯絲核菌侵染玉米葉片不同時期的表達(dá)特性。結(jié)果表明，克隆所得617bp序列與EST序列完全相同，在GenBank進(jìn)行Blastx同源比對，與gamma—glutamyhranspeptidase（Rhizoctoniasolani AG-3 RhslAP）有85%的同源性。實(shí)時熒光定量PCR表明，GGT在立枯絲核菌侵染玉米葉片各個時期均有表達(dá)，并存在明顯差異，其中在病菌侵染玉米葉片24 h時表達(dá)量最高。

關(guān)鍵詞：立枯絲核菌；GGT；基因克隆；表達(dá)分析

中圖分類號：S435.131.4+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0039-03

玉米紋枯病是世界玉米產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生、危害嚴(yán)重的世界性病害之一。近年來，隨著玉米栽培密度的提高，氮肥用量增加，形成有利于玉米紋枯病發(fā)生的小氣候條件，該病在某些地區(qū)危害日益嚴(yán)重，有逐年加重的趨勢。玉米紋枯病現(xiàn)已成為制約我國玉米持續(xù)增產(chǎn)的主要病害。

目前，關(guān)于真菌病害相關(guān)基因研究較多，杜欣可克隆了玉米紋枯病菌內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶的基因，用該基因構(gòu)建了酵母工程菌株，接種玉米葉片出現(xiàn)水浸狀病斑。崔福浩成功克隆了β-1，4-內(nèi)切纖維素酶基因，用該基因構(gòu)建了酵母工程菌株，接種試驗(yàn)表明，該基因可以殺死植物細(xì)胞。還有一些與代謝有關(guān)的基因已被克隆，Bowyer等發(fā)現(xiàn)引起禾谷類全蝕病的禾頂囊殼菌（Gaeuman-nomyces gramins）產(chǎn)生燕麥素酶分解燕麥根表皮細(xì)胞內(nèi)的皂角苷燕麥素，編碼該酶的基因突變后禾頂囊殼菌也就失去了對燕麥的致病力。關(guān)于玉米紋枯病菌y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因（Gamma一對utamyltranspeptida-se，GGT）未見報道，y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶是一種催化肽基轉(zhuǎn)移作用的酶，在H pylori誘導(dǎo)的線粒體介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡中，主要是通過誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素c進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和激活Caspase家族成員起作用，H pylori y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（y—glutamyl transpeptidase，GGT）在分泌和成熟后通過離子鍵與細(xì)胞膜結(jié)合，將細(xì)菌和宿主細(xì)胞直接連接起來。y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶廣泛存在于原核和真核細(xì)胞中，在動物體內(nèi)主要存在于腎、肝、胰等臟器，在谷胱苷肽的新陳代謝中起到了重要作用。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了立枯絲核菌cDNA文庫，獲得了329個高質(zhì)量ESTs序列。為了明確GGT在病菌侵染過程中的表達(dá)情況，通過對EST數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)所得序列設(shè)計引物，克隆了立枯絲核菌GGT，驗(yàn)證了前期EST序列測序結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，通過測定該基因在病原菌侵染過程中的表達(dá)量，探明該病原菌與寄主互作過程中的基因表達(dá)規(guī)律，為下一步研究侵染機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1材料

玉米立枯絲核菌（Rhizoctonia solani AG-IlA）菌株WF-9，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物免疫研究所保存。立枯絲核菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3d，刮取菌絲50～100mg，用于RNA提取、克隆。用離體葉片接種法，將培養(yǎng)3d的立枯絲核菌菌餅，放在玉米3葉1心期苗的葉片上進(jìn)行接菌，分別取0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米葉片（水漬狀發(fā)病處）100mg，用于各個侵染時期基因表達(dá)量分析。所有樣品經(jīng)液氮速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

提取菌株WF-9生長第3天樣品和0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米葉片總RNA，參照TaKaRa RNA提取試劑盒說明提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，使用Thermo公司Nano Drop ND 1000超微量分光光度計測定濃度，使用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.3立枯絲核菌GGT的克隆

筆者所在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了玉米立枯絲核菌AG-1-IA的全長cDNA文庫，并進(jìn)行了全長cDNA的隨機(jī)測序。在隨機(jī)測序中，分離出GGT EST片段，通過軟件拼接，得到長944 bp的基因，包含完整開放閱讀框。本試驗(yàn)根據(jù)所得序列開放閱讀框，利用軟件primer premier 5.0設(shè)計特異性引物c06-f：5'-CACGCATACTCCCGACTACT-3和c06-r：5-GCAACACCATFCTFCCTFGA-3。以eDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)?5℃ 4min；95℃45s，54℃ 45s，72℃ 1min，35個循環(huán)；72℃ 10min，4℃永久保存。PCR產(chǎn)物用天根切膠回收試劑盒回收，并與pMDl9-T載體（TaKaRa，日本）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4GGT序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用軟件包DNASTAR識別可讀框、推測氨基酸序列、預(yù)測等電點(diǎn)和分子量。同源搜索Blast分析在NCBI的網(wǎng)頁（http：//www.ncbi.nlnl.nih.gov/blast/）上完成，用Mega 4.0軟件構(gòu)建GGT氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5GGT表達(dá)分析

根據(jù)獲得的GGT核酸序列設(shè)計熒光定量PCR引物C060fr-F：5'-CTATCGCTCAGGCCATFGTT-3'，C060fr-R：5'-ATGCGTCGATCTCCTTGTG-3'；以立枯絲核菌GAPDH（基因登錄號AF339928）為內(nèi)參基因，設(shè)計內(nèi)參引物GAPDH—F：5'-GGTCGGCAAAGTCATACCAT-3'，GAPDH-R：5'-TCTGCGTCCTTCTTGGAGATA-3'。反應(yīng)在BIO-RADCFX96熒光定量PCR儀（BIO—RAD，美國）上進(jìn)行，反應(yīng)體系為cDNA模板（50mg/uL）2.0uL、上下游引物（10umol/L）各1uL、SYBR@Prenlix Ex TaqⅡ12.5uL和dH2O 8.5uL，每個樣品3個重復(fù)。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30s；95 qC 5 s，60 qC 30 s（single），共40個循環(huán)；95℃ 1s，65℃15s，95℃（continuous），溶解曲線測定；40℃ 30s。

2.結(jié)果與分析

2.1GGT的cDNA克隆

根據(jù)cDNA文庫所獲得序列開放閱讀框設(shè)計特異性引物，以總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增到600bp左右GGT的cDNA（圖1）。經(jīng)測序驗(yàn)證與EST片段序列一致，說明EST拼接序列結(jié)果正確。EST拼接測序得到一個長944 bp的序列，在NCBI進(jìn)行BLASTx對測序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，與ganlnla-glutanlyhranspeptidase（Rhizoctonia-lani AG-3 RhslAP）有85%的同源性。利用NCBI站點(diǎn)的ORF finder進(jìn)行6種可能的框架分析，發(fā)現(xiàn)該cDNA片段有一個完整的開放閱讀框，最長的閱讀框?yàn)?10-802，長度為693bp，編碼230個氨基酸（圖2）。

2.2同源性分析

根據(jù)GGT氨基酸序列，采用BLASTX在NCBI上進(jìn)行比對，下載了17條GGT同源序列，運(yùn)用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示克隆GGT與立枯絲核菌AG-3融合群同源性最近（圖3）。

2.3GGT在侵染各個時期表達(dá)差異分析

利用實(shí)時熒光定量PCR（real-time PCR）技術(shù)，以立枯絲核菌GAPDH為內(nèi)參，分析了GGT在立枯絲核菌不同侵染時間點(diǎn)（O、12、18、24、30、42、54、72 h）的表達(dá)情況。結(jié)果表明，GGT在立枯絲核菌侵染的各個時間點(diǎn)均有表達(dá)，但表達(dá)量存在明顯差異，在侵染12、18h時可能由于玉米自身防衛(wèi)反應(yīng)，GGT表達(dá)量明顯下調(diào)；而在24 h，GGT的表達(dá)量達(dá)到最高，可能是立枯絲核菌在寄主組織內(nèi)迅速擴(kuò)展，導(dǎo)致玉米葉片細(xì)胞開始程序性死亡，GGT的表達(dá)量達(dá)到最大；侵染54、72h表達(dá)量下降到相對平穩(wěn)狀態(tài)，可能是由于寄主大面積凋亡，病原與寄主互作概率減少造成的（圖4）。

3.討論

GGT是谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶，可特異性催化y-谷氨酰基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。GGT具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性，目前被廣泛接受的觀點(diǎn)是線粒體在凋亡的調(diào)節(jié)中起到了關(guān)鍵的作用。GGT對細(xì)胞的基本功能是線粒體結(jié)構(gòu)的維護(hù)，對膜的完整性及細(xì)胞分化和發(fā)育具有影響。GGT在真菌、植物細(xì)胞中代謝作用一直被忽略。在哺乳動物系統(tǒng)中，該酶已被反復(fù)使用，涉及谷胱甘肽重要的抗氧化響應(yīng)功能，并與半胱氨酸輸送到組織中。敲除GGT活性基因的小鼠有異常發(fā)育和早期死亡。為了進(jìn)一步弄清Rhizoctonia solani GGT在細(xì)胞凋亡中的作用及探索Rhizoctonia solani的侵染機(jī)制。本試驗(yàn)采用RT—PCR、基因克隆和核酸測序技術(shù)首次獲得R.solaniAG-IlA的GGT核酸序列，驗(yàn)證了前期EST序列測序的結(jié)果，EST拼接測序得到一個長944bp的序列，開放閱讀框?yàn)?10～802，長度為693 bp，編碼230個氨基酸。相對分子量24.7ku，理論等電點(diǎn)4.68。為后續(xù)的功能研究、蛋白制備及其抗體研制提供了良好的試驗(yàn)材料。

經(jīng)序列比對結(jié)果顯示，本研究克隆得到的GGT與Rhizoc-tonga solani AG-3 RhslAP的GGT氨基酸同源性最高，達(dá)到85%；系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果顯示與立枯絲核菌AG-3融合群同源性最近。后期利用real-time PCR分析GGT在立枯絲核菌侵染玉米葉片各個時間點(diǎn)的表達(dá)特性，表明GGT在立枯絲核菌侵染的各個時間點(diǎn)均有表達(dá)，但表達(dá)量存在明顯差異，其中在病菌侵染玉米葉片24h時表達(dá)量最高。本研究只對玉米紋枯病菌y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因（GGT）進(jìn)行了克隆，對病菌侵染玉米葉片不同時期的表達(dá)量進(jìn)行了分析。GGT是否參與致病，還需進(jìn)一步研究。