張逸風+蘇平+胡添源+周家偉+關紅雨+高偉+黃璐琦

[摘要]貝殼杉烯酸氧化酶（kaurenoic acid oxidase）是二萜赤霉素生物合成途徑上的關鍵酶，參與植物生長發(fā)育等重要生物學過程。該文根據(jù)雷公藤轉錄組數(shù)據(jù)設計特異性引物，采用PCR技術克隆得到貝殼杉烯酸氧化酶全長cDNA序列，并進行生物信息學分析；使用實時定量PCR（qRTPCR）研究基因的誘導表達水平?？寺〉玫絋wKAO長度為1 874 bp，編碼487個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量5602 kDa，理論等電點889；經(jīng)茉莉酸甲酯（MeJA）誘導后，TwKAO基因相對表達量在12 h達到峰值；經(jīng)植株組織表達分析證實，TwKAO基因在雷公藤的葉中表達量最高，根中最低。該研究首次克隆得到雷公藤KAO基因，并分析其mRNA表達特征，為深入研究雷公藤生長發(fā)育以及萜類活性成分次生代謝研究奠定基礎。

[關鍵詞]雷公藤； 貝殼杉烯酸氧化酶（KAO）； 克??； 生物信息學分析； 表達分析

藥用植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook f系衛(wèi)矛科木質(zhì)藤本植物，臨床中多使用其根或根的木質(zhì)部入藥，具有抗炎、神經(jīng)保護、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等活性，可用于治療類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫疾病。近年來發(fā)現(xiàn)，雷公藤中重要的二萜類成分雷公藤甲素在抗腫瘤尤其是治療胰腺癌[12]方面具有顯著療效。由于其廣泛的藥理活性，對雷公藤有效成分藥理作用、生物合成等方面的研究得到越來越多的關注[35]。

赤霉素是植物生長發(fā)育中必不可少的激素，參與植物生長包括種子萌發(fā)，莖伸長以及開花等過程。而赤霉素的生物合成過程中，從ent貝殼杉烯、ent貝殼杉醇、ent貝殼杉醛到ent貝殼杉酸，再到ent7過羥基貝殼杉烯酸等連續(xù)反應都是由 CYP450催化而成[6]。貝殼杉烯酸氧化酶（kaurenoic acid oxidase，KAO）參與從貝殼杉烯酸到GA12的反應過程[7]，其屬于細胞色素P450中CYP88A亞家族，參與赤霉素生物合成途徑中3步連續(xù)的催化反應[8]。目前，KAO基因已從小麥[910]，豌豆[11]，梨[12]等植物中克隆得到，并研究其缺失對向日葵矮小突變體的影響[13]。

雷公藤中KAO基因尚未克隆得到，因此本研究以雷公藤懸浮細胞為研究材料，克隆得到長度為1 874 bp的TwKAO基因，研究其在茉莉酸甲酯（MeJA）誘導后240 h內(nèi)基因的表達水平，并進行生物信息學分析，為進一步研究雷公藤重要活性成分生物合成提供寶貴的基因資源。

1材料

11植物雷公藤懸浮細胞由首都醫(yī)科大學中藥資源與分子生藥學實驗室繼代保存。培養(yǎng)條件：05 mg·L-1 2，4D + 01 mg·L-1 KT+05 mg·L-1 IBA+MS液體培養(yǎng)基，25 ℃，120 r·min-1避光培養(yǎng)。

12菌株及載體Escherichia coli Trans 5α感受態(tài)細胞、pEASYT3 vector購自北京全式金生物技術有限公司。

13儀器與試劑VeritiTM 96孔梯度PCR儀，TF 7500 型Real Time PCR System為美國 Applied Biosystems 公司，318k型高速冷凍離心機為SIGMA公司；PhusionHighFidelity PCR Master Mix with HF Buffer購自美國NEB公司；Fast Quant RT Kit （With gDNase）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、RNA純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，EastepSuper總RNA提取試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。引物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成，測序服務由北京睿博興科生物技術有限公司完成。

2方法

21RNA提取與純化使用CTAB法提取雷公藤懸浮細胞總RNA并依據(jù)RNA純化試劑盒說明書進行純化，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。

22全長cDNA克隆與測序使用Fast Quant RT Kit將雷公藤懸浮細胞總RNA反轉錄成cDNA，根據(jù)雷公藤懸浮細胞轉錄組數(shù)據(jù)設計全長特異性引物

24TwKAO基因的誘導表達分析于雷公藤懸浮細胞繼代培養(yǎng)12 d后，使用茉莉酸甲酯（50 μmol·L-1）誘導，設置對照組。于誘導后不同時間點（0，12，24，48，72，240 h）取樣，每個時間點設置4個平行樣品。使用EFLα基因作為內(nèi)參基因，根據(jù)所得TwKAO序列設計實時熒光定量特異性引物。提取雷公藤懸浮細胞總RNA并反轉錄成cDNA，進行TwKAO基因的誘導表達分析。實時熒光定量反應體系：10 μL 2×SYBR green Mix，04 μL ROXHigh、正反引物（10 μmol·L-1）各 04 μL，78 μL ddH2O和1 μL cDNA 。反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個反應重復 3次，用 2-ΔΔCt法分析其mRNA相對表達水平。

25TwKAO基因的組織表達分析使用EastepSuper總RNA提取試劑盒，分別提取3株生長年限相近的雷公藤植株根、莖、葉RNA并反轉錄成cDNA。使用EFLα基因作為內(nèi)參基因，進行TwKAO基因的組織表達分析。方法同誘導表達分析方法。

3結果與分析

31TwKAO基因全長cDNA獲得對雷公藤轉錄組設計的特異性引物進行全長PCR，克隆獲得長度為1 874 bp的TwKAO全長序列，見圖1。

32TwKAO基因序列分析TwKAO全長序列長度為1 874 bp，在152～1 615 bp位置具有完整的開放閱讀框（ORF），推測編碼487個氨基酸，序列的1～151 bp為5′UTR，1 616～1 874 bp為3′UTR。BLAST結果顯示，其與板栗Castanea mollissima相似度76%，與可可樹Theobroma cacao相似度76%，與川桑Morus notabilis相似度74%，與蘋果Malus domestica相似度74%，與西洋梨Pyrus communis相似度73%。使用DNAMAN軟件將TwKAO與板栗（AEF32085），川桑（XP_0100977241），蘋果（AGI656301），西洋梨（AGF252661），木豆（KYP520511），毛國楊（XP_0023194471）KAO氨基酸序列進行多重序列比對，結果表明相似度高達8220%。結合Interpro Scan結構域分析，TwKAO存在高度保守區(qū)Cytochrome P450 cysteine hemeiron ligand signature（427～436 aa位）：[FW][SGNH]x{F}[RKHPT]{P}C[LIVMFAP][GAD]，見圖2，亞鐵血紅素活性位點見圖中標注。

33TwKAO氨基酸序列的系統(tǒng)進化分析將TwKAO與GenBank下載的其他物種 KAO氨基酸序列進行比對分析，利用 MEGA 60軟件采用相鄰連接法構建系統(tǒng)進化樹，見圖3。選取15種植物（包括13種雙子葉植物，1種單子葉植物，1種蕨類植物）和2種真菌的KAO氨基酸序列，從進化樹中可以看出：雙子葉植物、單子葉植物、蕨類植物、真菌聚成單獨的分支，其中TwKAO歸為雙子葉植物分支。

34TwKAO理化性質(zhì)及3D結構預測使用ExPASy在線軟件ProtParamtool預測TwKAO蛋白得到其相對分子質(zhì)量5602 kDa，理論等電點889；帶負電荷的殘基（Asp+Glu）52，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）60；不穩(wěn)定系數(shù)3892，蛋白分類屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)8969，該蛋白為親水性蛋白。信號肽預測表明TwKAO為非分泌蛋白，不具有信號肽；亞細胞定位分析顯示其可能位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；同時跨膜域分析顯示，TwKAO位于膜外，為非膜蛋白。三維同源模型見圖4，以2ve31A蛋白為模板，用于建立模型的氨基酸殘基為36～482位，序列同源性2827%。

35TwKAO基因的誘導表達分析實時熒光定量PCR實驗檢測了MeJA處理后不同時期雷公藤懸浮細胞中TwKAOmRNA表達情況，采用2-ΔΔCt方法進行相對定量表達分析，見圖5。結果顯示，雷公藤懸浮細胞在受到MeJA刺激后12 h，TwKAO的相對表達量達到峰值，為同時期對照組的242倍，后相對表達量迅速降低回復至正常水平。

36TwKAO基因的組織表達分析實時熒光定量PCR實驗檢測了3株生長年限相近的雷公藤植株不同組織部位（根、莖、葉）TwKAO基因表達情況，見圖6。TwKAO基因的表達量在根、莖、葉中依次升高。葉中表達量最高，是莖表達量的149倍，是根中表達量的396倍。

4討論

植物赤霉素作為重要調(diào)節(jié)激素參與植物的生長發(fā)育，而赤霉素缺乏易引起植物發(fā)育不良，出現(xiàn)異于正常生長的矮小突變株。因此，對植物赤霉素生物合成途徑的解析及其關鍵酶的挖掘顯得尤為重要。本研究首次從雷公藤懸浮細胞中克隆得到雷公藤貝殼杉烯酸氧化酶基因，經(jīng)過結構域分析顯示其含有細胞色素P450的亞鐵血紅素活性位點，同時與其他已知物種KAO氨基酸序列相似度較高，因此命名為TwKAO。

KAO基因在不同品種及不同組織部位表達水平各不相同，在種子、葉等赤霉素合成較為旺盛的組織中表達量較高[12]。MeJA作為一種常用的誘導子，對種子萌發(fā)，根生長，果實成熟及衰老均有調(diào)節(jié)作用[14]。另外，茉莉酸類成分促使植物防御反應以應對蟲害、各種病原體及環(huán)境脅迫，如干旱、低溫和鹽脅迫等。Sophie等[15]通過MeJA處理擬南芥葉和根，發(fā)現(xiàn)氫過氧化物含量提高，表明體內(nèi)出現(xiàn)氧化應激反應。他們選擇擬南芥氧化還原反應蛋白作為研究對象，通過對比熒光標記和蛋白膠，確定大量氧化還原應答，MeJA處理后蛋白大量變化以應對，同時，壓力和防御蛋白也大量表達。此外，那些參與茉莉酸生物合成、次生代謝反應、細胞壁合成、編碼壓力保護和防御的基因都可被MeJA誘導表達上調(diào)[16]。本研究選擇雷公藤懸浮細胞繼代后12 d作為誘導初始時間，排除了細胞生長及逆境等因素造成植物基因表達的干擾，細胞生長穩(wěn)定，對照組可見基因相對表達量逐漸降低。經(jīng)過MeJA誘導后，TwKAO相對表達量僅在12 h達到峰值，為同時期對照組的242倍，后迅速下降至正常水平，符合MeJA對于植物誘導引發(fā)的應激反應規(guī)律。后期可以進一步分析赤霉素作為促進植物生長的激素與同樣對萜類次生代謝具有調(diào)節(jié)作用的MeJA二者生物合成途徑的關聯(lián)性。本研究成功克隆獲得雷公藤貝殼杉烯酸氧化酶基因，為深入研究雷公藤生長發(fā)育以及萜類活性成分次生代謝提供寶貴的基因資源。

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