楊廷桂+段修軍+董飚+孫國波+紀(jì)榮超+卞友慶

摘要：以浙東白鵝為研究對象，采用克隆、測序技術(shù)獲得浙東白鵝PRL基因789 bp的cDNA序列，包括了690 bp的編碼區(qū)，編碼229個(gè)氨基酸。并與其他物種進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該基因序列與其他鵝PRL序列相比發(fā)生了A170G、T315C、C316A、C318T、T516C、G617A突變;其中A170G發(fā)生了氨基酸H→R的變化，C318T處發(fā)生了氨基酸 H→N 的變化，G617A發(fā)生了氨基酸R→H的變化。與禽類PRL基因核苷酸和氨基酸序列同源性均在92.9%以上，與人和哺乳動(dòng)物同源性在51.8%～77.2%之間。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測鵝產(chǎn)蛋期到就巢期PRL基因在相關(guān)組織中的表達(dá)變化。在產(chǎn)蛋期和就巢期，垂體中PRL基因表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)組織，下丘腦、卵巢、輸卵管3個(gè)組織之間PRL基因mRNA表達(dá)量沒有顯著性差異。就巢期組織中PRL基因表達(dá)量極顯著高于產(chǎn)蛋期同一組織中 mRNA 表達(dá)量。

關(guān)鍵詞：浙東白鵝;PRL基因;基因克隆;mRNA表達(dá);繁殖;產(chǎn)蛋期;就巢期

中圖分類號： S835.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0024-03

收稿日期：2014-05-14

資助項(xiàng)目：江蘇省泰州市科技項(xiàng)目。

作者簡介：楊廷桂（1954—），男，江蘇揚(yáng)州人，教授，主要從事水禽育種與疾病防治研究。E-mail：tgy@126.com。

自然狀態(tài)下，禽類產(chǎn)蛋到一定階段就會(huì)產(chǎn)生就巢行為，這是禽類重要母性表征之一，也是禽類得以繁衍和進(jìn)化的保證。在世界眾多家禽品種中，大多數(shù)家禽仍然保持著或強(qiáng)或弱的就巢性。我國具有豐富的鵝遺傳資源，部分地方品種就巢性均較強(qiáng)。我國一些地方鵝種體型大，就巢性強(qiáng)，一般1年中產(chǎn)蛋3～4次，每次產(chǎn)蛋8枚左右就開始就巢孵化。如浙江省的浙東白鵝、安徽省的皖西白鵝、湖南省的溆浦鵝、廣東省的獅頭鵝、江蘇省的洪澤湖鵝等，這些鵝品種都是人類長期選育而得，是優(yōu)良的地方品種。擴(kuò)大這些品種的飼養(yǎng)量，是發(fā)揮其優(yōu)良特性的有效手段，但是就巢性影響了其快速擴(kuò)大的步伐。隨著鵝蛋人工孵化技術(shù)成熟，不需要鵝進(jìn)行就巢孵化。如何降低鵝的就巢行為、提高繁殖性能是廣大研究者關(guān)注的問題之一。

禽類就巢性的遺傳機(jī)理比較復(fù)雜，具體遺傳機(jī)理還不清楚。目前普遍認(rèn)為，就巢性是由環(huán)境、內(nèi)分泌系統(tǒng)、基因型相互作用的結(jié)果。下丘腦-垂體-卵巢軸是一個(gè)完整而協(xié)調(diào)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，它的每個(gè)環(huán)節(jié)均有其獨(dú)特的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，并且相互調(diào)節(jié)、相互影響。它的主要生理功能是控制雌性動(dòng)物的性功能，涉及到多種激素的作用，這些激素又是由基因控制的。催乳素（prolactin，PRL）是垂體前葉嗜酸細(xì)胞分泌的多肽類激素，對動(dòng)物的繁殖和泌乳、新陳代謝等起著調(diào)節(jié)作用[1]。催乳素的早期研究是測定禽類不同繁殖時(shí)期血液中催乳素的含量，發(fā)現(xiàn)雞、火雞、鴨、鵝就巢性的發(fā)生和維持都受到PRL的調(diào)控，在就巢期間PRL水平明顯上升，就巢結(jié)束時(shí)下降[2-3]。獅頭鵝在就巢期血清中PRL濃度最高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他繁殖階段[4]。郭軍等利用抑制消減雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)母鵝就巢時(shí)PRL基因表達(dá)上調(diào)，推斷PRL基因是影響就巢性的關(guān)鍵基因[5]。汪峰等發(fā)現(xiàn)雪山草雞種雞垂體中PRL基因的表達(dá)與其繁殖性能呈顯著負(fù)相關(guān)[6]。張學(xué)余等發(fā)現(xiàn)PRL基因調(diào)控區(qū)的插入/缺失（24 bp）能顯著影響72周齡白耳雞的產(chǎn)蛋數(shù)[7]。前人的研究均顯示催乳素基因在禽類生殖周期中起著重要的作用。

本研究擬以浙東白鵝為材料，設(shè)計(jì)引物，克隆浙東白鵝PRL基因，并分析其與GenBank中登錄的部分動(dòng)物PRL基因的同源性;采集產(chǎn)蛋期和就巢期垂體、下丘腦、卵巢、輸卵管組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測PRL在浙東白鵝繁殖過程中的表達(dá)規(guī)律，以進(jìn)一步豐富鵝就巢性分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為產(chǎn)蛋和就巢期的浙東白鵝（在第2個(gè)產(chǎn)蛋期期間）。在2個(gè)時(shí)間段內(nèi)隨機(jī)選取5只母鵝。屠宰放血后，采集下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管組織置液氮速凍，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中公布的禽類PRL基因序列，用DNAMAN進(jìn)行比較，尋找保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物送上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。引物序列及信息見表1，其中引物A1用于PRL基因克隆，A2、A3分別用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí)用于擴(kuò)增PRL、β-actin基因。

表1 基因克隆和mRNA表達(dá)所用引物信息表

引物名稱 引物序列（5′→3′） 作用

A1 F：CTTTCTGGCAGAGCAAGTC PRL基因克隆

R：TGGCAAAGCA ACAAGAACAC

A2 F：TGAAAGGTTTGTTGCTGGTGG 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

R：GGGCAGATAGGCAAGGAGGT

A3 F：CCCATCTATGAGGGCTACGC β-actin

R：TGATGTCACGGACGATTTCC

1.2.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用Trizol法提取浙東白鵝組織中總RNA，利用核酸濃度測定儀檢測RNA濃度和純度。按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進(jìn)行cDNA合成，以適量RNA為模板，以O(shè)ligo（DT）為引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。

1.3 PCR擴(kuò)增

以cDNA為模板，用引物A1進(jìn)行擴(kuò)增獲得PRL序列。PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR 緩沖液 （無Mg2+）2.5 μL，dNTP （2.5 mmol/L） 2 μL，MgCl2 （25 mmol/L）1.5 μL，上、下游引物 （10 pmol/L）各 1 μL，rTaq 聚合酶 （5 U/μL，Takara Tokyo，Japan）0.2 μL，cDNA模板 1 μL，dH2O 15.8 μL。

1.4 克隆及測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取目的條帶，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接。重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5-α，涂在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h。隨機(jī)挑取菌落，用菌液PCR法和酶切法篩選陽性克隆，每個(gè)基因挑選2～3個(gè)陽性克隆送上海桑尼生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

嚴(yán)格按照LC-480熒光定量PCR儀說明書進(jìn)行試驗(yàn)操作。用UltraSYBR Mixture（with Rox）進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。RealTime反應(yīng)體系為：UltraSYBR Mixture 10 μL，上游引物（10 μmol/L） 0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，模板 2 μL，加入滅菌蒸餾水至20 μL。

1.6 序列分析與數(shù)據(jù)分析

基因序列用NCBI上的Blast進(jìn)行序列比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.BLAST/），用DNAMAN 6.0生物軟件進(jìn)行序列的翻譯和作圖。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRL基因克隆和序列分析

2.1.1 PRL基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 對浙東白鵝垂體、卵巢等組織提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以A1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，結(jié)果見圖1。由圖1可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為800 bp左右，與引物設(shè)計(jì)時(shí)參照其他物種推測的長度相符，初步斷定其可能是PRL基因的序列。

2.1.2 序列分析結(jié)果 經(jīng)克隆測序獲得1個(gè)擴(kuò)增片段的cDNA序列，序列長度為789 bp（圖2）。進(jìn)一步序列分析，發(fā)現(xiàn)這段序列包括690 bp的編碼區(qū)，編碼229個(gè)氨基酸。將這段核苷酸序列編碼區(qū)與GenBank中的東北籽鵝（FJ527782）、皖西白鵝（DQ062571）、萊茵鵝（DQ066733）、馬 崗 鵝（DQ345783）的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該P(yáng)RL基因在編碼區(qū)序列中存在6個(gè)點(diǎn)突變，分別為A170G、T315C、C316A、C318T、T516C、G617A;其中A170G發(fā)生了氨基酸H→R的變化，C318T處發(fā)生了氨基酸H→N的變化，G617A發(fā)生了氨基酸R→H的變化。

2.1.3 不同物種間序列同源性比較 表2是根據(jù)PRL基因編碼區(qū)核苷酸、氨基酸序列采用軟件DNAMAN分析不同物種間同源性結(jié)果。由表2可知，浙東白鵝編碼區(qū)序列與野鴨（AB158610）、雞（NM_205466）、人（NM_000948）、小鼠（NM_011164）、豬（NM_213926）、牛（NM_173953）等動(dòng)物PRL基因序列核苷酸序列同源性為61.8%～98.8%，其中與野鴨同源性最高，與小鼠的同源性最低。進(jìn)一步進(jìn)行氨基酸序列比較可知，浙東白鵝與禽類中野鴨、雞的同源性較高，均在93.9%以上，與哺乳動(dòng)物豬的同源性也達(dá)到了77.2%，與小鼠的同源性僅有51.8%。

表2 浙江白鵝與不同動(dòng)物PRL基因氨基酸及核苷酸序列的相似性

指標(biāo)

相似性（%）

野鴨 雞 人 小鼠 豬 牛

核苷酸序列 98.8 92.9 70.1 61.8 73.1 68.7

氨基酸序列 99.1 93.9 68.3 51.8 77.2 68.4

2.2 PRL基因在組織中表達(dá)

本試驗(yàn)采用Real-Time PCR方法檢測了PRL基因在浙東白鵝垂體、下丘腦、卵巢、輸卵管4個(gè)組織中產(chǎn)蛋期和就巢期2個(gè)時(shí)期表達(dá)規(guī)律（表3）。由表3可知，無論在產(chǎn)蛋期還是在就巢期，垂體中PRL基因mRNA表達(dá)量顯著性高于其他3個(gè)組織，其他3個(gè)組織中之間PRL基因mRNA表達(dá)量沒有顯著性差異。與產(chǎn)蛋期相比，就巢期組織中PRL基因表達(dá)量極顯著高于產(chǎn)蛋期的同一組織中mRNA表達(dá)量（圖3）。

表3 浙東白鵝PRL基因在繁殖調(diào)控組織中的表達(dá)結(jié)果

組織 產(chǎn)蛋期表達(dá)量 就巢期表達(dá)量

垂體 9.19±0.98a 27.50±2.21a

下丘腦 1.36±0.21b 5.32±0.37b

卵巢 1.87±0.21b 5.68±0.46b

輸卵管 0.83±0.06b 6.02±0.48b

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

3 討論

浙東白鵝是我國優(yōu)良的肉用白鵝，其體型較大，廣受養(yǎng)殖者和消費(fèi)者的青睞，但是其產(chǎn)蛋量有限，年產(chǎn)蛋量在30枚左右，每次產(chǎn)蛋8枚左右就開始出現(xiàn)就巢現(xiàn)象，就巢時(shí)間約為產(chǎn)蛋期的2倍，同時(shí)就巢時(shí)卵巢和輸卵管退化，嚴(yán)重影響了浙東白鵝的產(chǎn)蛋量，制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展壯大。PRL通過下丘腦-垂體-卵巢軸引發(fā)禽類的就巢行為，是就巢行為發(fā)生和維持的重要基因之一。本研究首次從浙東白鵝卵巢組織中提取RNA，通過反轉(zhuǎn)錄、克隆、測序獲得了浙東白鵝PRL基因的cDNA序列，包含了完成的編碼區(qū)，共編碼229個(gè)氨基酸。通過序列比較，發(fā)現(xiàn)浙東白鵝PRL在不同鵝品種中存在6個(gè)點(diǎn)突變，分別為A170G、T315C、C316A、C318T、T516C、G617A，其中第1、第4、第6處的點(diǎn)突變引起了氨基酸序列發(fā)生了變化，表明鵝 PRL序列存在單核苷酸多態(tài)性，這些堿基變異導(dǎo)致了氨基酸殘基的差異，這是否是不同鵝品種就巢性和產(chǎn)蛋性能差異的原因，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

禽類的繁殖性能主要由卵泡發(fā)育數(shù)量和排卵頻率決定的，受到性腺軸的調(diào)控，分為下丘腦的長調(diào)控、垂體的中調(diào)控和卵巢的短調(diào)控作用。催乳素（PRL）是產(chǎn)蛋期、就巢期的重要功能基因，通過抑制下丘腦分泌促性腺激素釋放激素來實(shí)現(xiàn)對繁殖的抑制作用。下丘腦PRL表達(dá)的增加說明其通過反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)節(jié)催乳素的自分泌或旁分泌機(jī)制，進(jìn)一步增加催乳素表達(dá)。本試驗(yàn)采用Real-Time PCR方法檢測了PRL基因在垂體、下丘腦、卵巢、輸卵管4個(gè)組織中產(chǎn)蛋期和就巢期2個(gè)時(shí)期表達(dá)規(guī)律。在4個(gè)組織中，垂體中PRL基因的表達(dá)量一直處于最高位置，其他3個(gè)組織之間表達(dá)量沒有顯著性差異，這可能是由于垂體是催乳素的分泌器官。就巢期組織中PRL基因表達(dá)量極顯著高于產(chǎn)蛋期的同一組織中表達(dá)量，說明從產(chǎn)蛋期進(jìn)入就巢期鵝通過體內(nèi)內(nèi)源性PRL表達(dá)增加來維持就巢性狀，這與張響英等在獅頭鵝、魏茹華在皖西白鵝中的研究結(jié)果[4，8]一致，也與Kansaku在火雞[9]和Lea等在雞[10]上的試驗(yàn)結(jié)果相同。

禽類就巢性的發(fā)生是家禽的內(nèi)分泌激素、遺傳和環(huán)境等諸多因素共同作用的結(jié)果，其遺傳力低，通過常規(guī)的選育方法難以完全剔除就巢性。本研究克隆了浙東白鵝PRL基因編碼區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)PRL基因在就巢期表達(dá)量顯著增加，說明PRL基因在禽類就巢時(shí)的重要性;通過與其他鵝品種的序列比較，發(fā)現(xiàn)不同鵝品種序列之間存在點(diǎn)突變，本研究為開展PRL基因能否作為剔除就巢性的候選基因進(jìn)行了有益探索。

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