顧炳朝　岳緒國(guó)　楊軍　等

摘要：利用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（SNP）構(gòu)建鎮(zhèn)油6號(hào)等15個(gè)油菜品種（系）的指紋圖譜，分析它們之間的遺傳相似性，并通過(guò)聚類分析明確它們之間的關(guān)系；利用SSR標(biāo)記分析5個(gè)品種的遺傳相似系數(shù)，SNP標(biāo)記與SSR標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)間的相關(guān)系數(shù)為0.82，達(dá)顯著水平，表明2種方法所得的指紋圖譜間具有較高的一致性，但SNP標(biāo)記指紋圖譜所含差異位點(diǎn)信息較多，比SSR標(biāo)記圖譜更好。

關(guān)鍵詞：油菜；品種；指紋圖譜；聚類分析

中圖分類號(hào)： S634.301文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0087-03

收稿日期：2014-02-28

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（11）1026]；江蘇省科技支撐（農(nóng)業(yè)）計(jì)劃（編號(hào)：BE2013435）。

作者簡(jiǎn)介：顧炳朝（1956—），男，江蘇常州人，副研究員，主要從事油菜育種與品種推廣工作。Tel：（0511）87265433；E-mail：gbc0115@163.com。鑒別優(yōu)良品種的DNA指紋特性，對(duì)品種保護(hù)具有重要意義。SSR等分子標(biāo)記技術(shù)可鑒定個(gè)體或種群基因組之間的特異性DNA片段，通過(guò)大量的標(biāo)記分析可對(duì)品種的指紋圖譜作出鑒別[1-4]。為鑒別油菜的指紋圖譜，學(xué)者通過(guò)十多年研究，制定了油菜指紋圖譜的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 19557.1—2004），該標(biāo)準(zhǔn)從眾多的標(biāo)記中精選出40對(duì)引物用以鑒定油菜品種指紋圖譜，具有工作量小、快速有效的特點(diǎn)。油菜品種的鑒定包括形態(tài)鑒定、標(biāo)記鑒定、數(shù)量性狀鑒定等多個(gè)方面。在SSR指紋圖譜鑒定基礎(chǔ)上，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)某些品種的SSR標(biāo)記圖譜間沒有或者僅有很小的差異，這并不意味著2個(gè)材料就是完全相同的，還需要進(jìn)一步作種植鑒定[5-9]，若種植鑒定有差別可認(rèn)為是2個(gè)品種。出現(xiàn)這種情況的原因可能是標(biāo)記區(qū)段不能夠覆蓋油菜品種差異區(qū)段，或者指紋圖譜不夠精細(xì)導(dǎo)致品種基因組差異沒被檢測(cè)到。單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（SNP）技術(shù)的出現(xiàn)，為指紋圖譜鑒定提供了新方法[10-12]。采用芯片技術(shù)的SNP標(biāo)記分析方法可以提供數(shù)量眾多的標(biāo)記信息，在基因定位和基因功能研究等方面應(yīng)用廣泛，也是指紋圖譜鑒定的較好方法。油菜SNP芯片含有5.2萬(wàn)個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，可否用于鑒別油菜的指紋圖譜值得探討。本研究首次采用了SNP標(biāo)記技術(shù)，以油菜新品種鎮(zhèn)油6號(hào)等為材料[13-14]，研究這些品種的指紋圖譜，并且為油菜指紋圖譜鑒定提供新方法。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)所用油菜品種8個(gè)，分別為鎮(zhèn)油6號(hào)、Tapidor、中雙11號(hào)、寧油16、史力佳、史力豐、秦優(yōu)7號(hào)和油研817；以及鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成品系8個(gè)，分別為ZJ196、ZJ197、ZJ254、ZJ263、ZJ267、ZJ426、ZJ427和ZJ429。

1.2DNA的提取

供試材料在長(zhǎng)至6～8張真葉時(shí)取樣，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。SSR標(biāo)記試驗(yàn)采用SDS法提取DNA，SNP標(biāo)記試驗(yàn)采用CTAB法提取DNA。

1.3SSR標(biāo)記試驗(yàn)方法

采用GB/T 19557.1-2004《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南總則》中使用的40對(duì)SSR引物。SSR反應(yīng)體系采用10 μL體系：1 μL DNA（50 ng/μL），1 μL 10× PCR Buffer，0.2 μL dNTPs（2mM），0.1 μL TaqE（5 U/μL），0.5 μL F-Primer（50 ng/μL），0.5 μL R-Primer（50 ng/μL），6.7 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；4 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃終延伸10 min，4 ℃冰箱保存。PCR產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電泳電壓為210 V，時(shí)間75 min。固定，滲透，漂洗，顯色，最后拍照和記錄位點(diǎn)。

1.4SNP標(biāo)記試驗(yàn)方法

SNP標(biāo)記試驗(yàn)采用Infinium芯片技術(shù)。供試材料的DNA樣本交北京怡美通德公司完成DNA雜交和芯片檢測(cè)，獲得各個(gè)品種5.2萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)信息，作為指紋圖譜信息。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

各材料的SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用二元性編碼，即以1代表有譜帶，以0代表無(wú)譜帶，將所得到的0和1數(shù)據(jù)按順序排列構(gòu)成品種的指紋圖譜，計(jì)算遺傳相似系數(shù)。用非加權(quán)組平均法（ UPGMA ），采用Nei氏距離作聚類分析，采用NTSYSpc 2.1軟件繪制聚類圖。

各品種的52 157個(gè)SNP位點(diǎn)信息，同樣可作為指紋圖譜信息，并且用于計(jì)算遺傳相似系數(shù)。相似系數(shù)使用MATLAB軟件計(jì)算，然后用NTSYSpc 2.1軟件作聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1SNP標(biāo)記指紋圖譜

采用SNP芯片技術(shù)，檢測(cè)了15個(gè)品種（系）的SNP標(biāo)記多態(tài)性，并且利用多態(tài)性信息，計(jì)算了品種的相似系數(shù)和Nei氏距離（表1）。結(jié)果顯示，ZJ197與ZJ427之間的相似性系數(shù)最小，為0.55；ZJ427與ZJ426及ZJ197與秦優(yōu)7號(hào)的遺傳相似性系數(shù)最大，為0.74；鎮(zhèn)油6號(hào)與寧油16的遺傳相似性系數(shù)為0.62；鎮(zhèn)油6號(hào)與史力佳的系數(shù)為0.70，也比較大。鎮(zhèn)油6號(hào)、寧油16號(hào)、史力佳都屬于江蘇本省品種，遺傳系數(shù)居于中等水平。鎮(zhèn)油6號(hào)與中雙11號(hào)之間的相似性系數(shù)在0.59，與歐洲品種Tapidor的相似系數(shù)為0.61，是比較低的，說(shuō)明遺傳上相距較遠(yuǎn)。鎮(zhèn)油6號(hào)與本單位育成的8個(gè)品系（以ZJ命名）材料間的相似系數(shù)在0.58～0.62之間，說(shuō)明選用材料的遺傳差異較大，這與試驗(yàn)選材指導(dǎo)思想一致。通過(guò)遺傳相似系數(shù)可對(duì)不同材料作聚類分析（圖1）。從較遠(yuǎn)距離的情況看，可歸為2類，一類是ZJ426、ZJ427、ZJ429，其余12份材料可歸為另外一類。聚類圖可明確15個(gè)材料的遺傳相似性情況，這為親本選配和材料的遺傳特性評(píng)估提供了依據(jù)。表115個(gè)油菜品種（系）的SNP標(biāo)記遺傳相似系數(shù)

品種（系）

2.2SNP標(biāo)記與SSR標(biāo)記指紋圖譜的相關(guān)性

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的方法，采用40對(duì)SSR核心引物對(duì)5個(gè)遺傳材料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA特征帶型（圖2）。統(tǒng)計(jì)分析5個(gè)品種之間的指紋信息差別，得到遺傳相似性系數(shù)為0.54～0.76，其中鎮(zhèn)油6號(hào)和Tapidor的相似系數(shù)最小，為0.54，說(shuō)明它們遺傳關(guān)系遠(yuǎn)；而史力豐與史力佳之間的相似性系數(shù)最大，為0.76，說(shuō)明兩者遺傳來(lái)源相近（表2）。這些結(jié)果與材料的遺傳來(lái)源吻合較好。例如，史力豐和史力佳在遺傳上屬于系統(tǒng)系譜的后代，聚類上歸為一類而且相似系數(shù)最大（圖3）?？梢钥闯觯筒薙SR指紋圖譜國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用效果還是比較好的。

為研究SNP和SSR標(biāo)記指紋圖譜的一致性，采用相關(guān)性分析方法，計(jì)算SSR指紋圖譜的遺傳相似系數(shù)與SNP標(biāo)記指紋圖譜的相似系數(shù)間的相關(guān)性。結(jié)果表明，二者之間的相關(guān)系數(shù)為0.823 7，達(dá)顯著水平，說(shuō)明二者之間一致性較高，同時(shí)

表25個(gè)油菜品種的SSR標(biāo)記遺傳相似系數(shù)

品種遺傳相似系數(shù)中雙11號(hào)Tapidor史力豐史力佳Tapidor0.68史力豐0.580.60史力佳0.620.600.76鎮(zhèn)油6號(hào)0.590.540.660.71

也說(shuō)明2種方法所得的指紋圖譜還是有一定差別的。

3討論

物種的標(biāo)記包括形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記、SSR標(biāo)記、SNP標(biāo)記等多種類型。從標(biāo)記的豐富程度看，SNP標(biāo)記的豐富程度最大，SSR標(biāo)記的豐富程度較好，生化標(biāo)記和形態(tài)標(biāo)記的豐富程度最小。理論上，標(biāo)記的豐富程度越高，則分辨品種間差別的能力越強(qiáng)。采用SSR標(biāo)記開展作物指紋圖譜鑒定從方法學(xué)上看是比較好的。SSR標(biāo)記的多態(tài)性位點(diǎn)相對(duì)較多，目前油菜指紋圖譜鑒定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中采用的40對(duì)引物基本可以鑒別大多數(shù)品種的指紋差異。若品種采用回交等方式育成，可能導(dǎo)致品種間僅有個(gè)別區(qū)段差別，此時(shí)SSR標(biāo)記因?yàn)閿?shù)量有限，不能夠覆蓋基因組，則有可能難以分辨品種間的指紋差別，因此在指紋鑒定結(jié)果出現(xiàn)質(zhì)疑情況下，還需要進(jìn)行形態(tài)鑒定，以便給出品種鑒定的更加可靠的結(jié)論。油菜SNP標(biāo)記數(shù)量多達(dá)5萬(wàn)多個(gè)，近似平均覆蓋在全基因組上，可以更好地鑒別品種間的細(xì)微差別，可能是品種指紋圖譜鑒定的更好方法。但是用SNP標(biāo)記鑒定指紋圖譜也有相應(yīng)不足：（1）SNP標(biāo)記鑒定的成本較高，若只鑒定單個(gè)品種的指紋圖譜，則成本高達(dá)2萬(wàn)元以上，若批量鑒定則成本會(huì)有所降低；（2）SNP標(biāo)記技術(shù)依賴芯片技術(shù)，在芯片設(shè)計(jì)時(shí)需要根據(jù)若干親本差異核苷酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針，檢測(cè)得到位點(diǎn)信息，那么親本的選擇對(duì)指紋圖譜鑒定結(jié)果是有一定影響的；（3）SNP標(biāo)記能夠鑒別2個(gè)等位位點(diǎn)的差別，不能鑒別復(fù)等位性位點(diǎn)。

作物品種培育過(guò)程中，當(dāng)形態(tài)性狀達(dá)到一致時(shí)，即可認(rèn)為遺傳材料是穩(wěn)定的。然而，此時(shí)個(gè)體間仍然會(huì)有一些不易察覺的數(shù)量性狀差別，往往這種差別被認(rèn)為是由環(huán)境作用影響的結(jié)果，不被重視，這會(huì)導(dǎo)致遺傳材料因?yàn)榄h(huán)境改變而出現(xiàn)較大的遺傳分離現(xiàn)象。SNP標(biāo)記理論上可以鑒定純合和雜合位點(diǎn)，那么就應(yīng)該可以鑒別品種的純合性。然而，對(duì)各個(gè)品種（系）的雜合位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，各個(gè)品種（系）的雜合位點(diǎn)范圍是8.43%～40.76%。試驗(yàn)品種中無(wú)疑包括純合品種，中雙11號(hào)屬于純合親本，其雜合位點(diǎn)率最低。純合親本出現(xiàn)雜合位點(diǎn)可能是芯片技術(shù)出現(xiàn)數(shù)據(jù)判讀聚類分析智能性不夠高所造成的。不過(guò)，雜合位點(diǎn)百分率作為個(gè)體雜合性的參考指標(biāo)應(yīng)該是有意義的。研究中發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)油6號(hào)的雜合位點(diǎn)率比較低，為9.8%，說(shuō)明該品種的純合性比較好，而一些育種中間世代品系和雜交種的雜合位點(diǎn)百分率比較高。因此，從育種的角度看，利用遺傳材料的SNP標(biāo)記圖譜可以幫助說(shuō)明遺傳純合性問(wèn)題，使純合性判別更加有效。

參考文獻(xiàn)：

[1]閆華超，高嵐，李桂蘭. 分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用[J]. 生物學(xué)通報(bào)，2006，41（2）：17-19.

[2]趙淑清，武維華. DNA分子標(biāo)記和基因定位[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2000（6）：1-4.

[3]Singh A，Singh P K，Singh R，et al. SNP haplotypes of the BADH1 gene and their association with aroma in rice （Oryza sativa L.）[J]. Molecular Breeding，2010，26（2）：325-338.

[4]Boisson M，Mondon K，Torney V，et al. Partial sequences of nitrogen metabolism genes in hexaploid wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics，2005，110（5）：932-940.

[5]朱勇良，黃凌哲，謝裕林，等. 利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建蘇香粳1號(hào)的指紋圖譜[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（9）：34-35.

[6]陳鋒，張潔夫，陳松，等. 江蘇省油菜主栽品種的SSR指紋圖譜分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（6）：44-46.

[7]姚艷梅，徐亮，胡瓊，等. 青海省幾個(gè)主要春性甘藍(lán)型油菜雜交種的SSR分析[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2008，30（4）：406-410.

[8]龍衛(wèi)華，高建芹，浦惠明，等. 油菜新品種寧雜15號(hào)分子指紋圖譜的構(gòu)建[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（6）：1238-1242.

[9]陳碧云，伍曉明，張冬曉，等. 國(guó)家冬油菜區(qū)試新品種的SSR指紋圖譜分析[J]. 分子植物育種，2008，6（4）：709-716.

[10]蔣熒梅，劉春，吳劉成，等. SNP標(biāo)記對(duì)角膜混濁小鼠突變相關(guān)基因的精細(xì)定位[J]. 遺傳，2010，32（5）：486-491.

[11]Labate J A，Baldo A M. Tomato SNP discovery by EST mining and resequencing[J]. Molecular Breeding，2005，16（4）：343-349.

[12]鄭德波，楊小紅，李建生，等. 基于SNP標(biāo)記的玉米株高及穗位高QTL定位[J]. 作物學(xué)報(bào)，2013，39（3）：549-556.

[13]岳緒國(guó)，顧炳朝，唐澤慶，等. 鎮(zhèn)油6號(hào)的育種策略及優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培技術(shù)探討[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24（11）：46-48.