覃益民　張靜茹　葉錦+　等

摘要：康氏木霉GIMP3.444經(jīng)搖瓶發(fā)酵，獲得分泌到胞外的纖維素酶，粗酶液經(jīng)（NH4）2SO4分級(jí)沉淀、Sephacryl S200凝膠過(guò)濾層析、DEAE Sepharose FF離子交換層析及Octrl Separose CL-4B疏水層析分離純化出一種內(nèi)切型的β-葡聚糖苷酶，SDS-PAGE電泳鑒定為單一條帶，BIO-RAD分析相對(duì)分子量為61.8 ku。 該內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，最適反應(yīng)pH值為4.4，作用于羧甲基纖維素鈉時(shí)，Lineweaver-Burk法求得Km、Vmax分別為481 mg/mL、2.48 mg/（min·mL）。

關(guān)鍵詞：康氏木霉；內(nèi)切β-葡聚糖苷酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)： Q556+.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0040-04

收稿日期：2014-03-27

項(xiàng)目基金：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21276053）；廣西壯族自治區(qū)生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地開(kāi)放課題（編號(hào)：GXBF11-04）。

作者簡(jiǎn)介：覃益民（1962—），男，廣西貴港人，博士，副教授，主要從事生物加工與分離方面的研究。Tel：（0771）3233718；E-mail： qym6289@sina.com。植物纖維由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大部分組成并共同構(gòu)成了植物細(xì)胞壁的主要成分，是最豐富的天然可再生生物資源，纖維素通過(guò)纖維素酶水解轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，繼而轉(zhuǎn)化為燃料乙醇及相關(guān)化學(xué)品的研究越來(lái)越引起人們的關(guān)注[1]。纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，由內(nèi)切β-葡聚糖苷酶 （EG） 、 外切β-葡聚糖苷酶 （CBH）和 β- 葡萄糖苷酶 3 類酶組成。盡管大量研究已表明，只有在這3種主要成分酶的協(xié)同作用下，纖維素分子最終才能被降解成葡萄糖。但是各成分酶是如何協(xié)同起作用的，學(xué)者們的看法還不盡相同[2]，近來(lái)人們還發(fā)現(xiàn)了一些不具有纖維素酶活性的蛋白也能與纖維素酶起協(xié)同作用，并最終促進(jìn)纖維素的降解[3-5]。因此，無(wú)論是對(duì)纖維素酶系各成分酶的協(xié)同作用機(jī)理，還是對(duì)纖維素酶系與其他非酶蛋白的協(xié)同增效作用的更深入了解，都將會(huì)為提高纖維素酶的催化效率提供重要理論基礎(chǔ)?？凳夏久笹IMP 3.444是一株產(chǎn)纖維素酶系的真菌菌株[6]，筆者從該菌株中分離純化出一種纖維素酶協(xié)同增效蛋白。為進(jìn)一步研究該增效蛋白對(duì)纖維素酶各成分酶的協(xié)同作用機(jī)理，需獲得該菌株產(chǎn)的纖維素酶系各組分純酶。因此，本研究對(duì)康氏木霉GIMP3.444分泌的內(nèi)切β-葡聚糖苷酶進(jìn)行分離純化，并研究其酶學(xué)性質(zhì)。

1材料與方法

1.1菌株

康氏木霉（Trichoderma koningii）GIMP 3.444購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心，現(xiàn)保存于廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院生物化工實(shí)驗(yàn)室。

1.2培養(yǎng)基和試劑

（1）斜面活化培養(yǎng)基：200.0 g馬鈴薯、20.0 g 葡萄糖、30 g KH2PO4、1.5 g MgSO4·7H2O、20.0 g 瓊脂粉，加自來(lái)水至1 000 mL，調(diào) pH值至 6.0，121 ℃滅菌 20 m in。（2）搖瓶種子培養(yǎng)基：200.0 g 馬鈴薯、20.0 g 葡萄糖、30 g KH2PO4、1.5 g MgSO4·7H2O，加自來(lái)水至1 000 mL，調(diào)pH值至 6.0，121 ℃滅菌 20 m in。（3）液體發(fā)酵培養(yǎng)基：15.0 g 甘蔗渣（過(guò)80目篩）、8.0 g 麥麩粉、4.0 g （NH4）2SO4 、3.0 g KH2PO4 、1.5 g MgSO4·7H2O，加自來(lái)水至1 000 mL，調(diào)pH值至6.0，121 ℃滅菌 20 min。（4）DNS試劑：稱取6.3 g 3，5-二硝基水楊酸、20.96 g NaOH、182.0 g酒石酸鉀鈉、5.0 g苯酚、5.0 g 亞硫酸鈉，分別用去離子水溶解后混合，待混合液冷卻至室溫定容至 1 000 mL。保存在棕色瓶中，在室溫下放置 7 d 即可使用。（5）考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100 mg，溶于50 mL 95%乙醇中，再加入100 mL 85%磷酸，混合均勻后用去離子水定容至1 000 mL。

1.3菌種的培養(yǎng)

取保存的康氏木霉接種于斜面活化培養(yǎng)基，28 ℃條件下活化培養(yǎng)3～7 d，刮取平面孢子，用無(wú)菌水制成孢子懸浮液，按1%體積比（V/V）接種至種子培養(yǎng)液中，于180 r/min、28 ℃下培養(yǎng)30～36 h。將搖瓶種子按5%體積比（V/V）接種量接種至裝有150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于 180 r/min、28 ℃下培養(yǎng)120 h。

1.4內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的分離純化

1.4.1發(fā)酵液的預(yù)處理取“1.3”節(jié)培養(yǎng)好的發(fā)酵液，用4層紗布過(guò)濾，在4 ℃、6 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，用截留分子量為10 000 Da的VIVAFLOW 200平板超濾膜濃縮20倍左右，得到粗酶液。粗酶液先用20%飽和度的硫酸銨沉淀，4 ℃下靜置過(guò)夜；6 000 r/min離心20 min，取上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為80%，4 ℃下靜置過(guò)夜；離心得沉淀，用0.05 mol/L pH值7.0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液復(fù)溶，再次離心后，去除不溶物，復(fù)溶酶液4 ℃冰箱保存。

1.4.2Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾層析取2.0 mL的鹽析復(fù)溶液，上樣于Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾柱（10 mm×700 mm）中，用0.05 mol/L pH值 7.0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（含NaCl 0.2 mol/L）洗脫，用自動(dòng)收集器按 2.0 mL/（管·10 min） 收集組分，測(cè)定每管內(nèi)切β-葡聚糖酶活力，收集有內(nèi)切β- 葡聚糖酶活性洗脫峰，4 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.4.3DEAE Sepharose FF離子交換層析取“1.4.2”節(jié)收集的蛋白樣，用VIVAFLOW 50平板超濾膜濃縮，并用 0.05 mol/L pH值 7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液置換，上樣至DEAE Sepharose FF陰離子交換柱（16 mm×200 mm）中，0～0.8 mol/L NaCl濃度梯度洗脫，自動(dòng)收集器 5 mL/（管·5min） 收集組分，測(cè)定各峰的內(nèi)切β-葡聚糖酶活力，收集內(nèi)切β- 葡聚糖酶活性峰，4 ℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4Octrl Separose CL-4B疏水層析取“1.4.3”節(jié)中收集的內(nèi)切β-葡聚糖酶活性峰，超濾濃縮并用含（NH4）2SO4 2.0 mol/L的0.05 mol/L pH值 7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液置換，上樣至Octrl Separose CL-4B疏水層析柱（10 mm×400 mm）中，2.0～0 mol/L （NH4）2SO4 濃度梯度洗脫，自動(dòng)收集器3 mL/（管·10 min） 收集組分，測(cè)定各峰的內(nèi)切β- 葡聚糖酶活力，收集內(nèi)切β-葡聚糖酶活性峰，4 ℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5測(cè)定方法

1.5.1蛋白濃度的測(cè)定以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，用考馬斯亮藍(lán)G-250法[7]測(cè)蛋白液濃度。

1.5.2內(nèi)切β-葡聚糖苷酶活力（EG）測(cè)定采用DNS法[8]測(cè)定內(nèi)切酶活性。向試管中加入1.5 mL 10 g/L的羧甲基纖維素鈉檸檬酸-檸檬酸鈉溶液（0.1 mol/L，pH值 4.8）及 0.5 mL 酶液，50 ℃水浴中保溫30 min，取出后加入 3.0 mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5 min，取出流水冷卻，定容至 25 mL，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以每分鐘催化底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)活力單位，單位用IU/mL表示。

1.5.3蛋白質(zhì)純度鑒定及相對(duì)分子量測(cè)定采用SDS-PAGE法[9]。聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的分子質(zhì)量范圍1.44×104～9.74×104 ku。

1.5.4最適反應(yīng)溫度測(cè)定將純酶稀釋后，在pH值 4.8條件下，于不同溫度（25 ℃～80 ℃）水浴中與底物保溫30 min，測(cè)定內(nèi)切β-葡聚糖苷酶活力，以最大酶活力為100%，確定酶的最適反應(yīng)溫度。

1.5.5最適反應(yīng)pH值測(cè)定分別用不同pH值（2.6～8.0）的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配置1%的羧甲基纖維素鈉懸浮液，作為不同pH值條件下的酶作用底物，加入用相應(yīng)pH值緩沖液稀釋的純酶，在50 ℃水浴中保溫30 min，測(cè)定不同pH值下的內(nèi)切β-葡聚糖苷酶活力，以最大酶活力為100%，確定酶的最適反應(yīng)溫度。

1.5.6底物動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定分別配置濃度為0.1%、015%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%的羧甲基纖維素鈉懸浮液（pH值 4.8），加入適當(dāng)稀釋純酶液，在50 ℃水浴中保溫30 min，DNS法測(cè)定各不同濃度底物時(shí)產(chǎn)生的還原糖，然后按照Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法[10]作圖，計(jì)算出該酶作用于羧甲基纖維素鈉時(shí)的Km值和Vmax值。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的分離純化及分析

康氏木霉發(fā)酵液經(jīng)20～80%硫酸銨分級(jí)沉淀，上樣至Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾層析柱，洗脫流速為 0.2 mL/min，洗脫結(jié)果如圖1所示，共有3個(gè)蛋白峰。酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)第3個(gè)蛋白峰沒(méi)有纖維素酶活性，為雜蛋白，而峰Ⅰ、峰Ⅱ均具有較高的內(nèi)切β-葡聚糖苷酶活性，說(shuō)明康氏木霉的發(fā)酵液中至少含有2種內(nèi)切酶。本研究?jī)H介紹對(duì)第1個(gè)蛋白峰的分離純化。

收集圖1中的峰Ⅰ蛋白，超濾法濃縮并進(jìn)行緩沖液置換后，上樣至用0.05 mol/L pH值 7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液平衡的DEAE Sepharose FF離子交換層析柱，分別用3倍柱體積的含NaCl 0.1、0.2、0.3、0.8 mol/L的緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為1.0 mL/min，結(jié)果如圖2所示，共有5個(gè)蛋白吸收峰，經(jīng)測(cè)定內(nèi)切酶活主要集中在峰3中。

合并圖2峰3蛋白，超濾濃縮用含（NH4）2SO4 2.0 mol/L 的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液置換，上樣至平衡的Octrl Separose CL-4B疏水層析柱，分別用3倍柱體積的含 1.0 mol/L （NH4）2SO4緩沖液和無(wú)（NH4）2SO4的緩沖液洗脫，流速為0.3 mL/min，如圖3所示，得到3個(gè)蛋白峰，經(jīng)酶活測(cè)定，發(fā)現(xiàn)只有第3個(gè)峰具有內(nèi)切酶活性（圖中記為EG）。

取經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾層析、DEAE Sepharose FF離子交換層析、Octrl Separose CL-4B疏水層析純化的內(nèi)切β- 葡聚糖酶進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4表明，通過(guò)以上4步純化過(guò)程，內(nèi)切β-葡聚糖酶的純度逐步提高，且經(jīng)疏水層析后的酶組分在SDS-PAGE電泳膠上顯示為單一條帶，表明該組分已達(dá)電泳純，凝膠成像系統(tǒng)分析內(nèi)切β-葡聚糖酶的相對(duì)分子量約為61.8 ku，比文獻(xiàn)[11-14]報(bào)道的康氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶大，也偏大于里氏木霉[15-16]內(nèi)切葡聚糖酶，而與綠色木霉[17]和擬康氏木霉[18]中的內(nèi)切葡聚糖酶相近。

內(nèi)切β-葡聚糖酶的分離純化過(guò)程如表1。表1表明硫酸銨分級(jí)沉淀除去了部分的非酶雜蛋白，純度提高了132倍。而Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾層析對(duì)內(nèi)切β-葡聚糖

酶的提純效果不太理想，在鹽析的基礎(chǔ)上內(nèi)切酶只被純化了1.34倍，這是因?yàn)樵邴}析樣中有多種內(nèi)切酶共存，此時(shí)測(cè)得的內(nèi)切酶活力會(huì)高于凝膠過(guò)濾層析后得到的內(nèi)切β- 葡聚糖酶活力。DEAE Sepharose FF離子交換層析也能去除較多的雜蛋白和多糖物質(zhì)，內(nèi)切β-葡聚糖酶的比活力達(dá)到 983 IU/mL，純化了2.98倍。經(jīng)過(guò)Octrl Separose CL-4B疏水層析，內(nèi)切葡聚糖酶最終達(dá)到電泳純，此時(shí)比活力為 24.91 IU/mg，與粗酶液相比，提高了7.55倍，回收率為3.72%。

表1康氏木霉內(nèi)切β- 葡聚糖酶的分離純化

純化過(guò)程總蛋白

（mg）總活力

（IU）比活力

（IU/mg）回收率

（%）純化

倍數(shù)粗酶液496.721 639.183.30100.001.0020%～80%（NH4）2SO4 332.801 451.014.3688.521.32Sephacryl S-200 HR162.93953.145.8558.151.77DEAE Sepharose FF 24.82243.989.8314.882.98Octrl Separose CL-4B 2.4561.0324.913.727.55

2.2內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度為了測(cè)定反應(yīng)溫度對(duì)內(nèi)切β-葡聚糖苷酶活性的影響，確定酶的最適反應(yīng)溫度，在同一pH值條件下，分別測(cè)定不同反應(yīng)溫度時(shí)的酶活力，以最大酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖5。圖5表明，在 25～55 ℃ 范圍內(nèi)，內(nèi)切酶活力隨著溫度升高而增加，在55 ℃時(shí)酶活力最大，說(shuō)明內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃；溫度繼續(xù)升高，內(nèi)切酶活力逐漸降低，80 ℃時(shí)，酶活力僅有最高活力的16.3%。在55～75 ℃范圍內(nèi)，酶活力隨溫度升高而降低的斜率的絕對(duì)值大于低溫范圍內(nèi)酶活力隨著溫度升高而增加的斜率，說(shuō)明該內(nèi)切酶對(duì)高溫更敏感。

2.2.2內(nèi)切酶的最適反應(yīng)pH值用不同pH值的緩沖液配置酶反應(yīng)底物，測(cè)定pH值對(duì)內(nèi)切β-葡聚糖苷酶活性的影響，以確定酶的最適反應(yīng)pH值，分別將該酶與上述底物在 50 ℃ 條件下反應(yīng)，測(cè)定內(nèi)切β-葡聚糖苷酶活力，以最大酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖6?？梢?jiàn)，當(dāng)pH值小于4.4時(shí)，內(nèi)切酶活力隨著pH值的增大而增加，至pH值 4.4時(shí)酶活力達(dá)最大值，故該內(nèi)切酶的最適最適pH值為44；pH值 4.4～8.0范圍內(nèi)，內(nèi)切酶活力隨著pH值的繼續(xù)增大而降低，但在pH值為6.2時(shí)，酶活力仍有最大值的758%，這可能是因?yàn)樵搩?nèi)切酶在pH值 4.4～6.2之間活性較穩(wěn)定。

2.2.3內(nèi)切酶的底物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)將稀釋的純酶液分別與不同濃度底物反應(yīng)，測(cè)定生成的還原糖量，然后按照Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖，結(jié)果如圖7?；貧w得出標(biāo)準(zhǔn)方程為1/v=1.942 1（1/[S]）+0.403 9，求得以羧甲基纖維素鈉為底物時(shí)，內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的Km值為 4.81 mg/mL，Vmax值為2.48 mg/（min·mL）。

3結(jié)論

本研究從康氏木霉液態(tài)搖瓶發(fā)酵液中分離純化得到一種電泳純的內(nèi)切β-葡聚糖苷酶，比活力為24.91 IU/mg，相對(duì)分子量為61.8 ku。酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定結(jié)果顯示，純化的內(nèi)切β-葡聚糖苷酶無(wú)外切β-葡聚糖苷酶及β- 葡萄糖苷酶活性，作用于羧甲基纖維素鈉時(shí)，Km為4.81 mg/mL，Vmax為 2.48 mg/（min·mL），最適反應(yīng)溫度為55 ℃，最適反應(yīng)pH值為4.4，可用來(lái)分析纖維素酶系蛋白之間的協(xié)同水解作用。

本研究結(jié)果還表明，康氏木霉分泌的內(nèi)切β-葡聚糖苷酶不止一種，因此，在研究纖維素酶系各成分酶的協(xié)同作用機(jī)理或研究纖維素酶系與其他非酶蛋白的協(xié)同增效作用時(shí)，須考慮同功酶存在的影響。

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