魯黎明，陳 勇，魯逸飛，李立芹

（四川農業(yè)大學農學院，成都 611130）

低鉀脅迫對煙草幼苗碳氮代謝基因表達譜的影響

魯黎明，陳 勇，魯逸飛，李立芹*

（四川農業(yè)大學農學院，成都 611130）

為探索煙草響應低鉀脅迫的分子機制，對K326煙草幼苗進行了0、6、12和24 h的低鉀脅迫處理，并利用定制的煙草全基因組芯片，分析了煙草幼苗基因表達譜的變化。結果表明，與0 h相比，6、12和24 h的3個時間點差異表達在2倍以上（p＜0.05）的基因總數為3790個。從功能方面看，這些差異表達基因廣泛參與了煙草的各種生物學過程，包括抗氧化活性、應激反應、運輸活性、發(fā)育過程、催化活性、生物調節(jié)、代謝過程等。其中包括了硝酸還原酶基因NIA2等10個參與煙草氮代謝的基因，以及UGP等44個參與煙草碳水化合物與糖代謝的基因。本研究結果說明，低鉀脅迫對煙草的基因表達產生了廣泛的影響，進而可能影響到煙草的碳氮等基礎代謝。

煙草；低鉀脅迫；基因表達譜；基因芯片；碳氮代謝

鉀是煙草的一個重要品質元素。然而，與國外優(yōu)質煙葉相比，我國煙葉中的鉀含量較低［1-2］。研究表明，由于植物生長對鉀的需求量較大，土壤中含鉀量往往不足以滿足植物生長發(fā)育的需要［3］。為適應這種低鉀環(huán)境，植物產生了一整套調節(jié)機制，如功能基因的誘導表達［4-9］、信號轉導與調節(jié)途徑的運作［10-11］。近年來，基因芯片技術以其高通量、全方位的特點，在植物響應非生物脅迫的機制研究方面得到了廣泛的應用［12］。如擬南芥［13-15］及水稻［16-20］分別響應低氮、低磷的研究均表明，在脅迫條件下，擬南芥及水稻的基因表達譜均發(fā)生了較大的變化。其中，Ma等［11］對水稻響應低鉀脅迫的研究證實，編碼碳氮代謝、信號蛋白、轉錄因子及礦質元素轉運蛋白的基因，均參與了這種脅迫響應。在煙草的生長發(fā)育后期，也經常遇到土壤中有效鉀含量不足的問題。所以，探索煙草響應低鉀脅迫的分子機制，對于提高煙葉鉀含量具有重要的意義。因此，本研究利用基因芯片技術，分析低鉀脅迫下煙草參與碳氮代謝的基因表達譜的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

試驗材料為烤煙品種K326（Nicotiana tabacum cv. K326），基因芯片為美國安捷倫公司煙草全基因組芯片。

煙草種子表面消毒后，播種于MS培養(yǎng)基上，并放于光照培養(yǎng)室進行全光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃。無菌苗培養(yǎng)4周后，進行低鉀脅迫處理（0、6、12和24 h），重復3次。將煙草幼苗移到低鉀培養(yǎng)基［21］上，并在上述4個時間點進行取樣，迅速于液氮中冷凍備用。

1.2 基因表達譜芯片分析

煙草樣品總RNA的抽提采用TRIZOL法，按照試劑盒說明書的要求進行。使用QIAGEN RNeasy? Kit 純化總RNA。然后，使用Nanodrop ND-1000及Agilent BioAnalyzer 2100進行總RNA質檢。

芯片雜交：cDNA的合成、cRNA的制備、Cy3單色熒光標記、標記產物的片段化等均按照美國安捷倫公司的基因芯片雜交標準流程進行。芯片雜交過程與數據采集由上海伯豪生物技術有限公司芯片雜交平臺完成。

1.3 數據處理與分析

基因表達信號經歸一化后，各處理與對照信號值進行比對，若foldchange變化的比值≥2為該基因表達上調，比值≤-2.0則該基因表達下調，以此篩選出每組對比中的差異表達基因。登陸上海伯豪生物公司的SAS分析系統(tǒng)（http://www. shanghaibiotech.com）進行數據分析，并對差異表達基因進行GO（Gene Ontology）功能分析。

Cluster聚類分析使用Cluster3.0軟件進行。差異基因的表達趨勢分析采用STEM（Short Timeseries Expression Miner）軟件進行。

1.4 RT-qPCR驗證

隨機挑選出3個上調表達和3個下調表達基因作為驗證基因，引物采用primer 3.0軟件進行設計，由生工生物工程有限公司合成。RT采用Invitrogen的反轉錄試劑盒，按照說明書進行。SYBR Green qPCR采用10 μL反應體系（2×SYBR Green PCR buffer 5ul，正反向引物各0.2 μL，模板DNA 5 ng，用ddH2O加至10 μL），反應條件為95 ℃，5 min，95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，40個循環(huán)。

2 結 果

2.1 差異表達基因總體特征

利用上海伯豪生物公司的SAS分析系統(tǒng)，對芯片數據進行了分析。以P＜0.05且變化倍數在2倍以上為條件，梳理了差異表達的基因。3個時間點共計富集到3790個差異表達基因（DEGs）。與0 h相比，6 h時間點差異表達基因達2277個，其中，上調表達1270個，下調表達1007個；12 h為1954個，其中，上調表達1159個，下調表達795個；24 h為1835個，其中，上調表達1023個，下調表達812個。6 h時間點差異表達基因數量較多，同時，在3個時間點，上調基因的數量總是比下調基因多。在上調表達的DEGs中，3個處理時間點一直都處于上調的基因有300個；在下調表達的DEGs中，3個處理時間點一直都處于下調的基因有257個，共計557個。該類基因在低鉀脅迫后一直處于活躍狀態(tài)，可能與低鉀脅迫有著密切的聯(lián)系。

差異表達基因可以分為8種表達趨勢（圖1，A-H），趨勢中各基因的表達一致性較強，變化動態(tài)較一致。這些表達趨勢相似的基因，可能在某些生理生化過程中處于協(xié)同關系，或者具有類似的功能。

2.2 RT-qPCR驗證

為檢驗基因芯片檢測結果的準確性，在差異表達基因中，隨機挑選了3個上調和3個下調基因作為驗證基因，進行RT-qPCR的驗證。結果表明基因芯片技術對基因表達檢測的準確性較高。

圖1 煙草響應低鉀脅迫的基因表達模式分析Fig. 1 Expression profiles of tobacco seedlings under potassium deficiency

2.3 差異表達基因的功能分析

在P（0.05）顯著水平下，這些差異表達基因可以歸納為18種功能，如抗氧化活性、結構分子活性、電子載體活性、應激反應等（圖2）。說明低鉀脅迫引發(fā)了煙草幼苗多種生理生化反應。

表1 RT-qPCR所用引物Table1 Primers for RT-qPCR

2.4 氮代謝過程相關基因

氮代謝是植物體內的基礎代謝過程，直接影響著植物的生長發(fā)育，也是植物產量形成的主要影響因素［22-24］。在本研究中，低鉀引起了氮代謝過程中的相關基因的變化（表2）。如硝酸還原酶NIA2、谷氨酸合成酶GLT1、谷氨酰胺合成酶AtGSR1等。這些基因均集中于植物氮代謝的起點，即無機氮同化為有機氮的過程。

圖2 差異表達基因的功能分析Fig. 2 GO analysis of DEGs

表2 氮代謝途徑中的重要基因Table 2 Nitrogen metabolic genes

2.5 碳水化合物代謝相關基因

碳水化合物及糖類代謝是植物的最基本的初生代謝，直接影響著植物的基本生命活動［25-26］。本研究發(fā)現(xiàn)，在低鉀脅迫下，煙草幼苗參與碳水化合物代謝的基因中，有44個基因的表達發(fā)生了顯著變化，其中上調28個，下調16個（表3）。這些差異表達基因主要參與了光合作用碳同化、呼吸作用之糖酵解與PPP途徑、蔗糖合成以及淀粉代謝等生化過程。本結果說明，低鉀脅迫可能導致了煙草幼苗光合作用與呼吸作用發(fā)生改變。

3 討 論

3.1 低鉀對氮代謝的影響

本試驗結果表明，低鉀脅迫導致了煙草編碼硝酸還原酶、谷氨酸合成酶與谷氨酰胺合成酶等基因的表達均發(fā)生了明顯變化。此結果與擬南芥及水稻的研究結果相一致［10-11］。在本研究中，硝酸還原酶基因的表達在3個時間點均處于下調，而谷氨酰胺合成酶基因則均上調表達。由于這些基因在根部參與無機氮同化過程，因此，可以推測，在外界環(huán)境缺鉀時，煙草氮同化會受到抑制，從而可能會抑制煙草的生長。

3.2 低鉀對碳代謝的影響

研究表明，低鉀環(huán)境中，擬南芥根中碳氮代謝酶基因的表達發(fā)生了明顯的改變，丙酮酸、蘋果酸及硝酸鹽等的含量也明顯下降［27］。供鉀恢復正常時，其含量又回歸正常。MA等［11］在水稻的研究也得到了類似的結果，有兩個PEPCK基因表達顯著下調。本研究也發(fā)現(xiàn)，低鉀條件下，煙草有44個差異表達基因參與了糖及碳水化合物的代謝。它們參與了碳固定、EMP、PPP、蔗糖合成以及淀粉代謝等途徑。其中，有5個丙酮酸激酶基因的表達上調。由此可見，低鉀脅迫時，煙草通過改變基礎碳代謝基因的表達，調整基礎代謝，以適應外界的脅迫環(huán)境，保證植株的正常生長。

4 結 論

在低鉀脅迫下，煙草幼苗眾多基因的表達發(fā)生了顯著的改變。其中，包括了硝酸還原酶基因NIA2等參與無機氮同化的基因，以及UGP等參與碳水化合物代謝的基因。說明煙草在低鉀脅迫時，可能通過調節(jié)基因的表達，影響到碳氮等基礎代謝。本研究的結果為煙草響應低鉀脅迫的分子機制研究提供了參考。

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表3 參與碳水化合物及糖代謝相關差異表達基因Table 3 DEGs involved in carbohydrate and sugar metabolism of tobacco seedlings under low potassium stress

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The Impact of Low Potassium Stress on Tobacco Gene Expression Profiles of Carbon and Nitrogen Metabolism

LU Liming， CHEN Yong， LU Yifei， LI Liqin*
（Agronomy College of Sichuan Agriculture University， Chengdu 611130， China）

In order to explore the molecular mechanism of tobacco potassium nutrition， tobacco seedlings of K326 were treated with low potassium stress for 0， 6， 12 and 24 h. Gene expression profiles of tobacco seedlings at each time point were analyzed. The results showed that a total of 3790 genes were detected with a change of two folds or more in expression level （p＜0.05）. GO analysis showed that these differentially expressed genes can be divided into functional classifications including antioxidant activity， stress response，transport activity， development process， catalytic activities， biological regulation， metabolism， etc. Among them， 10 genes， including the nitrate reductase gene NIA2， were involved in nitrogen metabolism， and 44 genes， such as UGP， were involved in the metabolism of carbohydrate and sugar. The results of this study indicate that low potassium stress has a broad impact on gene expression of tobacco，and it may affect the metabolism of carbon and nitrogen in tobacco.

tobacco； low potassium stress； gene expression profiling； gene chips； carbon and nitrogen metabolism

S572.01

1007-5119（2015）04-0012-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.04.002

國家自然科學基金“E3參與植物響應低磷脅迫的分子機制”（31070244）

魯黎明，男，博士，副教授，研究方向為煙草鉀遺傳育種。E-mail：luliming@sicau.edu.cn。*通信作者，E-mail：lilq88@126.com

2015-05-05

2015-07-14