范群艷

(1.廈門市絲濃食品有限公司，福建 廈門 361101;2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

?

BBD法優(yōu)化燕窩唾液酸水提工藝及燕窩水解物對(duì)果蠅壽命的影響

范群艷1,2

(1.廈門市絲濃食品有限公司，福建 廈門 361101;2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

采用水提法提取燕窩唾液酸，并運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)確定唾液酸的最優(yōu)水提工藝；在果蠅培養(yǎng)基中添加燕窩水解物，研究其對(duì)果蠅壽命的影響.結(jié)果表明,燕窩唾液酸的最優(yōu)水提工藝條件為:液料比20∶1、水提溫度103 ℃、水提時(shí)間23 min，按此工藝條件得到的唾液酸提取率為(9.08±0.12)%.燕窩水解物可延長雌雄性果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間，在果蠅培養(yǎng)基中添加1.2 g·L-1燕窩水解物均可延長雌雄性果蠅的壽命，壽命延長率分別達(dá)20.4%和16.8%，表明燕窩在延長果蠅存活時(shí)間方面有一定的作用.

燕窩; 唾液酸; 果蠅; 延長壽命

燕窩是雨燕科幾種金絲燕分泌的唾液及其絨羽混合粘結(jié)所筑成的巢穴[1-2].燕窩的功效最早記載于清代名醫(yī)張璐的《本經(jīng)逢原》中，其作為藥食兩用的高檔滋補(bǔ)品，深受國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛.

唾液酸又名燕窩酸，是燕窩最主要的生物活性成分，占燕窩總質(zhì)量的7%-15%.唾液酸具有提高嬰兒智力和記憶力、抗病毒、抗腫瘤、抗老化、抗炎癥和抑制凝集等作用[3-6].

燕窩的主要食用方式為水燉煮，而水提法是常被用于食品中營養(yǎng)成分和天然活性成分提取的方法，該方法工藝簡單、操作便捷、生產(chǎn)成本低[7].近幾年國內(nèi)外對(duì)燕窩的研究主要集中在真?zhèn)舞b別方面，對(duì)燕窩中的特征成分——唾液酸提取的研究鮮有報(bào)道.因此，本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)水提法，探討不同水提條件對(duì)燕窩唾液酸提取率的影響，運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)獲得唾液酸水提的最佳工藝條件；并以果蠅為對(duì)象，研究在其培養(yǎng)基中添加燕窩水解物對(duì)果蠅壽命的影響，旨為燕窩作為抗衰老保健食品和藥品的開發(fā)提供參考，也為燕窩的綜合利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

燕窩原產(chǎn)于馬來西亞，由廈門市絲濃食品有限公司提供；唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品由Sigma公司出品；95%乙醇、氫氧化鈉、硫酸銨、冰醋酸、茚三酮等試劑均為分析純(AR).

主要儀器設(shè)備有PL602-L電子天平(梅特勒—托利多儀器上海有限公司)、DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、L530離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)(尤尼科上海儀器有限公司)、THZ-82型水浴恒溫震蕩器(常州國華電器有限公司)、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、DS-200型電動(dòng)高速組織搗碎機(jī)(江蘇江陰市科研器械廠)、LDZX-75KB高溫高壓鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)、RXZ智能型人工氣候箱(寧波江南儀器廠).

1.2 燕窩樣品的制備

稱取一定量的燕窩研磨過篩后置錐形瓶中，加入適量水浸泡1 h，調(diào)節(jié)pH，隔沸水燉煮30 min.取勻漿后的燕窩水解物10 mL，加入10 mL 50%醋酸，使用高溫高壓鍋水解，取出后迅速冷卻，將燕窩水解物定容至50 mL.

1.3 唾液酸提取率的測(cè)定

圖1 唾液酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Sialic acid standard curve

唾液酸可與酸性茚三酮發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的黃色溶液，并在470 nm波長處有最大吸收峰[8].分別配制0、5、10、20、50、100和200 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)唾液酸溶液，吸取1 mL，加1 mL冰醋酸和1 mL酸性茚三酮，水浴10 min，待其冷卻后在470 nm波長處測(cè)定光密度(D).以唾液酸含量為橫坐標(biāo)，以D470 nm為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1).

取10 mL燕窩唾液酸水解液至離心管中，加入1.25 g硫酸銨蛋白沉淀劑，攪拌至沉淀劑溶解，在3000 r·min-1高速離心機(jī)中離心10 min.取上清液1 mL，與酸性茚三酮和冰醋酸混合搖勻，在沸水浴中保溫10 min，取出試管，冷卻后于470 nm波長處測(cè)定D.

1.4 燕窩唾液酸水提工藝的設(shè)計(jì)

選擇液料比、水提溫度、水提時(shí)間和pH進(jìn)行單因素試驗(yàn)(表1);根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取水提時(shí)間、水提溫度和料液比進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)(表2)。

表1 單因素設(shè)計(jì)因素水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.5 燕窩水解物對(duì)果蠅壽命影響的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制 稱取17 g玉米粉、13 g蔗糖和1.5 g瓊脂粉置500 mL燒杯中，加入170 mL蒸餾水?dāng)嚢杌靹颍陔姶艩t上加熱煮沸，待稍冷后加入1.5 g酵母粉和1 mL丙酸，充分調(diào)勻，分裝[9].

1.5.2 燕窩培養(yǎng)基的配制 燕窩研磨過40目篩，稱取0.12 g置錐形瓶中，加入20 mL水，浸泡1 h，調(diào)節(jié)pH至7，隔沸水水提30 min.取勻漿過的燕窩水解物20 mL，備用.

在果蠅的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入低劑量(0.6 g·L-1)、中劑量(1.2 g·L-1)和高劑量(1.8 g·L-1)的燕窩水解物，制得樣品培養(yǎng)基.

1.5.3 果蠅生長情況的觀察 收集在8-10 h內(nèi)未交配羽化的果蠅，乙醚麻醉后平鋪于紙上鑒別雌雄.選取雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組50只，每天定時(shí)觀察并記錄對(duì)照組(飼喂基礎(chǔ)培養(yǎng)基)和各燕窩劑量組(飼喂燕窩培養(yǎng)基)果蠅的存活數(shù)、死亡數(shù)，直至全部死亡為止.果蠅的培養(yǎng)基每3天更換1次.

半數(shù)死亡時(shí)間：每組有一半數(shù)量果蠅死亡的天數(shù)即為半數(shù)死亡時(shí)間；壽命延長率/%=(試驗(yàn)組平均壽命-對(duì)照組平均壽命)/對(duì)照組平均壽命×100；生長曲線：以壽命為橫坐標(biāo)，存活率為縱坐標(biāo)記錄果蠅生長情況的曲線.

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 燕窩唾液酸水提工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)唾液酸提取率的影響 由圖2可知，燕窩唾液酸的提取率隨著液料比的增大呈上升趨勢(shì)，在液料比為20∶1時(shí)達(dá)到最大值，而后趨于平緩.

2.1.2 水提溫度對(duì)唾液酸提取率的影響 由圖3可知，燕窩唾液酸的提取率隨著水提溫度的升高呈緩慢上升趨勢(shì)，在溫度達(dá)到100 ℃時(shí)達(dá)到最大值，但溫度繼續(xù)升高時(shí)提取率略有下降，這可能是由于溫度過高，在一定程度上破壞了唾液酸的成分.

圖2 料液比對(duì)唾液酸提取率的影響

2.1.3 水提時(shí)間對(duì)唾液酸提取率的影響 由圖4可知，水提開始時(shí)，燕窩唾液酸的提取率隨著水提時(shí)間的延長而升高，水提時(shí)間為20 min時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著水提時(shí)間的繼續(xù)延長，提取率不再升高反而略有下降.受熱時(shí)間過長會(huì)破壞唾液酸的成分.因此，水提時(shí)間以20 min為最佳.

2.1.4 pH對(duì)唾液酸提取率的影響 唾液酸在人體組織中基本以結(jié)合態(tài)的形式與黏多糖、糖蛋白和糖脂中的低聚糖鏈相連[10]，偏酸或偏堿條件可能會(huì)破壞唾液酸的結(jié)構(gòu)，不利于唾液酸的提取.由圖5可知，隨著pH的升高，燕窩唾液酸的提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在pH為7時(shí)達(dá)到最大值.

圖4 水提時(shí)間對(duì)唾液酸提取率的影響

2.2 燕窩唾液酸水提工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 BBD響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水提時(shí)間(A)、水提溫度(B)和料液比(C)為試驗(yàn)因素，唾液酸提取率(Y)為指標(biāo)進(jìn)行BBD響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表3、4所示.

表3 BBD響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表4 回歸模型方差分析

從表4可以看出:該模型的一次項(xiàng)A、B均極顯著，C顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2及交互項(xiàng)AC、BC極顯著;所選用的試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M的P為0.0003，表明回歸模型極顯著(P≤0.01);失擬項(xiàng)為0.576，表明模型組的純誤差并不顯著，可以用來分析和預(yù)測(cè)燕窩水提工藝的最佳條件.

利用Design Expert 7.0軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得燕窩唾液酸提取率(Y)與水提時(shí)間(A)、水提溫度(B)和液料比(C)交互關(guān)系的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=9.040-0.160A+0.160B-0.061C+0.038AB+0.087AC+0.180BC-0.240A2-0.560B2-0.570C2.對(duì)該方程中的各因素求解一階導(dǎo)數(shù)，得到最佳的提取工藝條件為：液料比19.39∶1、水提溫度102.53 ℃、水提時(shí)間為22.64 min.在此工藝條件下，唾液酸提取率的預(yù)測(cè)值為9.28%.

從圖6-8可以看出，各因素間的交互作用顯著.水提溫度為100-105 ℃時(shí)，唾液酸的提取率隨著水提時(shí)間的延長顯著提高；料液比為15∶1-20∶1時(shí)，提取率隨著水提時(shí)間和水提溫度的上升而不斷提高；水提時(shí)間為20-25 min時(shí)，隨著水提溫度的上升，提取率變化顯著.

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 為進(jìn)一步驗(yàn)證最佳響應(yīng)點(diǎn)的值，進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn).根據(jù)實(shí)際情況將工藝條件調(diào)整為：液料比20∶1、水提溫度103 ℃、水提時(shí)間23 min，在此工藝條件下，唾液酸的提取率為(9.08±0.12)%，與理論預(yù)測(cè)值接近，精準(zhǔn)率達(dá)97.84%，證明該響應(yīng)面模型所得方程能較準(zhǔn)確地反應(yīng)各因素對(duì)唾液酸提取率的影響.

圖6 水提時(shí)間與水提溫度對(duì)唾液酸提取率的等高線圖與響應(yīng)面圖

圖7 水提時(shí)間與料液比對(duì)唾液酸提取率的等高線圖與響應(yīng)面圖

圖8 水提溫度與液料比對(duì)唾液酸提取率的等高線圖與響應(yīng)面圖

2.3 燕窩水解物對(duì)果蠅壽命的影響

2.3.1 對(duì)果蠅存活時(shí)間的影響 動(dòng)物體的衰老是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，壽命是衡量衰老的一個(gè)最重要指標(biāo)[11].果蠅自然生命周期較短，在25 ℃的適宜環(huán)境下，從卵、幼蟲、蛹到成蟲不過10 d，成蟲的自然壽命也只有50-60 d.由于果蠅體形小，可以采用較多樣本做試驗(yàn)，從而減少了抽樣誤差，因而果蠅常被作為延緩衰老試驗(yàn)的研究對(duì)象.

從表5可見：各燕窩劑量組雌雄性果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間均長于對(duì)照組，其中，中劑量組雌雄性果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間分別達(dá)59和52 d；低、中、高劑量組雄性果蠅的壽命延長率分別為12.7%、16.8%和11.9%，雌性果蠅分別為15.5%、20.4%和13.0%.雌性果蠅的壽命均長于雄性果蠅，這與雌雄性果蠅的個(gè)體差異有關(guān)，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究.

表5 燕窩水解物對(duì)果蠅存活時(shí)間的影響

2.3.2 對(duì)果蠅生長曲線的影響 從果蠅生長曲線(圖9、10)可以看出，與對(duì)照組相比，各燕窩劑量組雌雄性果蠅的生長曲線均出現(xiàn)右移，中低劑量組與高劑量組的生長曲線較為相似.進(jìn)一步揭示了燕窩在延長果蠅存活時(shí)間方面有一定的作用.

圖9 雄性果蠅的生長曲線

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了傳統(tǒng)水提工藝各因素對(duì)燕窩唾液酸提取率的影響，采用BBD法得到最優(yōu)的水提工藝條件為：液料比20∶1、水提溫度103 ℃、水提時(shí)間23 min.在此工藝條件下，唾液酸的提取率可達(dá)(9.08±0.12)%.

在果蠅的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加燕窩水解物飼喂果蠅，可延長果蠅的壽命，且中劑量組果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間、壽命延長率均最高，雌雄性果蠅的壽命延長率分別達(dá)20.4%和16.8%，表明燕窩具有一定的延緩衰老作用，其影響機(jī)理需進(jìn)一步研究.

[1] 林潔茹,周華,賴小平.燕窩研究概述[J].中藥材,2006,29(1):85-90.

[2] 胡雅妮,康廷國.燕窩的研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2003,28(11):10-12.

[3] 李紅衛(wèi),王冰.唾液酸與腦發(fā)育相關(guān)的新型營養(yǎng)物質(zhì)[J].中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2010,44(3):256-258.

[4] WANG B Y, KARIM M. Dietary sialic acid supplementation improves learning and memory in piglets [J]. American Journal of Clinical Nutrition, 2007,85:561-569.

[5] 程鋮.高春芳.唾液酸的生物學(xué)意義及其在肝病中的研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,4(28):333-336.

[6] 侯燕,冼小敏,林潔茹,等.燕窩對(duì)ConA刺激下大鼠淋巴細(xì)胞增殖的增效作用[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2010,17(26):9-11.

[7] 陳嬋.蓮子多糖提取及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2007:12-15.

[8] 黃雪珍.分光光度法鑒別燕窩真?zhèn)渭鞍攵繙y(cè)定燕窩的百分含量[J].海峽藥學(xué),2007,9(8):78-79.

[9] 周波,王曉紅,郭連營,等.玉米紫色植株花色苷色素延緩衰老的功能[J].中國臨床康復(fù),2006,10(19):138-140.

[10] 陳海嬌,王萍,陳越,等.高效液相色譜法測(cè)定母乳中唾液酸含量[J].食品科學(xué),2011,32(16):308-311.

[11] 邵偉,劉趙昆,劉方.玫瑰花提取物抗衰老作用的研究[J].南開大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2013,41(3):65-68.

(責(zé)任編輯:施曉棠)

Optimum process conditions of birds nest sialic acid by aqueous extraction and the effects on extending the lifespan of drosophila

FAN Qun-yan1,2

(1.Xiamen Seelong Food Co. Ltd., Xiamen, Fujian 361101, China; 2.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

The aqueous extraction process of birds nest sialic acid and the effect of sialic acid on drosophila life were verified. The results showed that the experimental sialic acid yield of (9.08±0.12)% was achieved under the conditions of solid-liquid ratio 20∶1, temperature 103 ℃, time 23 min, and pH 7. Compared to the control group, each test group of drosophila had longer mean time to death. Medium dose groups extended the life of the female and male drosophila to 20.4% and 16.8% respectively. It suggests that bird nest sialic acid has the function of anti-aging.

birds nest; sialic acid; vinegar fly; extend the lifetime

2014-07-26

2014-09-19

廈門市科技計(jì)劃項(xiàng)目(3502Z20141070).

范群艷(1981-)，男，碩士研究生.研究方向：食品科學(xué).Email:fanqunyan729@126.com.

R284.2

A

1671-5470(2015)04-0424-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.04.016