楊曉東 馬雪梅 孫云暉 林楊 鮑文華

肺癌是一種主要起源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，而非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌的80%，具有高度侵襲性與轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征，但病因至今尚不完全明確，其發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)采用免疫組化S-P法對(duì)IL-27與LTB4在肺癌標(biāo)本中表達(dá)情況和相互關(guān)系進(jìn)行研究。探討兩者在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為肺癌的臨床診治提供一種理論依據(jù)及治療方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本選取本院2012-2014年手術(shù)切除的肺組織石蠟標(biāo)本60例，均已確診為非小細(xì)胞肺癌。女28例，男32例，年齡43~77歲，平均58.3歲。按1999年WHO肺癌分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，其中鱗癌34例、腺癌26例；高分化20例、中分化24例、低分化16例；按UICC1997肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)分期，Ⅰ+Ⅱ期38例、Ⅲ期22例。入選標(biāo)準(zhǔn)：所有分類(lèi)及分期均執(zhí)行目前國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)；所有標(biāo)本術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療；所有標(biāo)本均重新證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌。同時(shí)選取25例正常肺組織作為對(duì)照研究。

1.2 主要試劑 IL-27抗體、LTB4抗體、S-P試劑盒為通用型。

1.3 方法 免疫組化采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶（S-P）法。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片機(jī)上作4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)及血清封閉等處置，分別與IL-27、LTB4抗體免疫組化染色，DAB顯色，同時(shí)把已知的陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌組織切片在相同情況下染色作為陽(yáng)性對(duì)照，所有操作方法均嚴(yán)格執(zhí)行S-P試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 結(jié)果判斷 所有結(jié)果均由本院病理專(zhuān)業(yè)的醫(yī)師統(tǒng)計(jì)。IL-27以胞核染色為主，LTB4以胞膜或胞漿為主，呈棕黃色顆粒狀染色，以清晰的棕黃色顆粒作為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。取五個(gè)不同的視野，在400倍光鏡下各自計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，以陽(yáng)性細(xì)胞/同類(lèi)細(xì)胞%為標(biāo)準(zhǔn)，將免疫組化結(jié)果分為：陰性（-）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%；弱陽(yáng)性（+）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%~25%；中度陽(yáng)性（++）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%~50%；強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：細(xì)胞數(shù)>50%。前兩者為低表達(dá)，后兩者為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用 X2檢驗(yàn)，兩種蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-27與LTB4在非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織中的表達(dá)水平 在非小細(xì)胞肺癌組織中IL-27與LTB4總陽(yáng)性表達(dá)率分別為41.67%、63.33%，各種蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在肺癌組織與正常肺組織間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 IL-27與LTB4在肺癌和正常肺組織中表達(dá)情況的比較 例（%）

2.2 IL-27與LTB4的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征之間的關(guān)系 IL-27在肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為41.67%，其表達(dá)水平與肺癌的細(xì)胞分化程度和TNM分期相關(guān)（P<0.05），與肺癌患者的組織學(xué)類(lèi)型無(wú)密切關(guān)系（P>0.05）；LTB4在肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為63.33%，其表達(dá)水平與肺癌患者的組織學(xué)類(lèi)型、TNM分期無(wú)密切關(guān)系（P>0.05），而與肺癌細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 IL-27與LTB4的表達(dá)與肺癌病理特征之間的關(guān)系情況

2.3 IL-27與LTB4表達(dá)的相關(guān)性 IL-27與LTB4之間相關(guān)性統(tǒng)計(jì)表明兩者間有明顯相關(guān)性，Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.624（P<0.05）。兩者在肺癌組織中的陽(yáng)性共表達(dá)情況見(jiàn)表3。

表3 IL-27與LTB4在肺癌組織中的陽(yáng)性共表達(dá)情況 例

3 討論

白 細(xì) 胞 介 素 27（interleukin-27，IL-27）是 在2002年P(guān)flanz等發(fā)現(xiàn)的IL-6/IL-12家族的新型細(xì)胞因子[1]，它由EB病毒誘導(dǎo)基因3亞基和p28亞基組成，主要通過(guò)調(diào)節(jié)Th1、Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子參與自身免疫性疾病達(dá)到促進(jìn)和抑制炎癥的雙重性質(zhì)。目前關(guān)于IL-27與各種腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究在我國(guó)日趨完善[2]，IL-27與前列腺癌及其骨轉(zhuǎn)移、食管癌淋巴轉(zhuǎn)移、黑色素瘤等腫瘤密切相關(guān)[3]，在肺癌方面，轉(zhuǎn)染IL-27的小鼠肺腺癌實(shí)驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行，研究表明：腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞通過(guò)IL-27調(diào)節(jié)參與機(jī)體抗腫瘤或者在活體直接起到抗腫瘤增殖作用[4]。血管形成作用和NK細(xì)胞被IL-27抑制，從而抑制了腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[5]。并且最近研究表明免疫炎癥反應(yīng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[6]，本項(xiàng)研究證實(shí)IL-27陽(yáng)性表達(dá)率在非小細(xì)胞肺癌組織中為41.67%，顯著低于正常肺組織（88.00%）（P<0.05），而且隨著肺癌的細(xì)胞分化程度降低IL-27的陽(yáng)性表達(dá)也隨之下降（P<0.05），因此IL-27可能是一種潛在的抗腫瘤細(xì)胞因子，IL-27主要通過(guò)CD8+T細(xì)胞，分泌IFN-r發(fā)揮抗腫瘤作用，對(duì)免疫原性高、低不同的腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移作用，尤其對(duì)免疫原性低的腫瘤發(fā)揮無(wú)可比擬的作用[7]，其可以通過(guò)抑制血管形成來(lái)抑制腫瘤的增值。IL-27尚可不依賴(lài)免疫細(xì)胞而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，并且目前研究一致認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)IL-27可以產(chǎn)生免疫保護(hù)和免疫記憶。因此IL-27基因可能成為腫瘤治療的靶基因，認(rèn)定是腫瘤治療的新靶點(diǎn)[8]，當(dāng)前白介素藥物治療主要立足于感染性疾病治療[9]，但對(duì)于肺癌治療提供了前提依據(jù)，并有望成為繼手術(shù)治療、化療及放療后的一種新的肺癌治療模式。

白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）作為花生四烯酸的代謝產(chǎn)物之一，是一種潛在的炎癥介質(zhì)和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，其代謝通路主要為：在各種酶的催化下，花生四烯酸轉(zhuǎn)變成環(huán)化物白三烯A4（LTA4）。LTA4在 LTA4水解酶作用下形成LTB4。LTA4水解酶和5-脂氧合酶是白三烯合成過(guò)程中具有調(diào)節(jié)作用的酶[10]。LTB4受體有兩種亞型即BLT1和BLT2，BLT1少量表達(dá)于脾臟和胸腺，其主要在白細(xì)胞中呈高表達(dá)。BLT2在脾臟中表達(dá)最高，卵巢、肝臟、白細(xì)胞中次之。另外，BLT2在CD+的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中也均有表達(dá)[11]。LTB4與食管癌、結(jié)腸癌、口腔癌、胰腺癌、人間變性大細(xì)胞淋巴瘤等多種腫瘤關(guān)系密切[12-13]。本項(xiàng)研究證實(shí)非小細(xì)胞肺癌組織中LTB4陽(yáng)性表達(dá)率為63.33%，顯著高于正常肺組織（16.00%）（P<0.05），而且LTB4的陽(yáng)性表達(dá)隨肺癌的細(xì)胞分化程度降低而升高（P<0.05），分析LTB4可能為一種致癌或促癌因子，在肺癌發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用。Chen等[14]對(duì)LTB4和腫瘤發(fā)生的機(jī)制研究認(rèn)為與炎癥相關(guān)的致癌作用有關(guān)：第一、炎癥細(xì)胞、上皮細(xì)胞所引起的LTB4旁分泌生長(zhǎng)刺激效應(yīng)、自分泌生長(zhǎng)刺激效應(yīng)兩者均作用于癌細(xì)胞和癌前病變。第二、LTB4受體與信號(hào)分子形成正反饋，從而加強(qiáng)了LTB4對(duì)炎癥細(xì)胞的作用。其作用機(jī)制可能還有許多不明之處，但目前較確切的是LTB4參與肺癌發(fā)病中，而其受體拮抗劑則與其發(fā)揮作用相反。研究表明，LTB4受體抑制劑對(duì)腫瘤有明顯抑制作用，因此如能應(yīng)用于臨床將對(duì)腫瘤治療有著極大發(fā)展前景[15]。目前很多成熟的白三烯抑制劑已經(jīng)在臨床廣泛應(yīng)用[16]，針對(duì)腫瘤的制劑亦在研制中。

IL-27與LTB4的陽(yáng)性表達(dá)在本研究中表明與患者性別、年齡等無(wú)相關(guān)性。IL-27肺癌低分化組的陽(yáng)性率為18.75%明顯低于高、中分化組均數(shù)55.42%（P<0.05），其陽(yáng)性表達(dá)隨腫瘤病理分化程度的降低而降低（P<0.05），spearman相關(guān)性分析顯示：在非小細(xì)胞肺癌組織中IL-27的表達(dá)與TNM分期成正相關(guān)（r=0.654，P<0.001），而與組織類(lèi)型無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。LTB4在非小細(xì)胞肺癌組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與肺癌的細(xì)胞分化程度負(fù)相關(guān)（r=-0.754，P<0.001），與病理學(xué)類(lèi)型及TNM分期無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。在此實(shí)驗(yàn)組非小細(xì)胞肺癌組織中，IL-27、LTB4表達(dá)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)論表明兩者之間呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.624，P<0.001）。

本項(xiàng)研究證實(shí)了在肺癌復(fù)雜發(fā)病過(guò)程內(nèi)，IL-27與LTB4均參與了肺癌發(fā)生、發(fā)展的病理生理過(guò)程，因此筆者對(duì)兩者進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)既豐富了肺癌發(fā)病機(jī)制理論也將對(duì)抗腫瘤藥物研制起到一定啟發(fā)，從而勢(shì)必對(duì)肺癌的臨床早期發(fā)現(xiàn)及早期診治起到影響意義。

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