靳興濤，王惠娥 ，繆增強(qiáng)，蘇勇華

(塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300)

卵泡發(fā)育是一個(gè)以形態(tài)變化為特征的動(dòng)態(tài)生長過程，同時(shí)伴有卵泡功能的分化。原始卵泡經(jīng)過發(fā)育和分化可形成優(yōu)勢卵泡，使卵子成熟并排出，也可中途閉鎖［1］。抑制素是下丘腦 垂體 性腺軸調(diào)控系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)激素，對卵泡的正常生長、分化及閉鎖起到刺激或抑制作用。抑制素對FSH 具有調(diào)節(jié)作用已經(jīng)被許多研究所證實(shí)，但它作用機(jī)制目前尚有爭議。

抑制素(Inhibin，INH) 是雄性動(dòng)物的睪丸支持細(xì)胞C 和雌性動(dòng)物的卵巢顆粒細(xì)胞所分泌的二聚體糖蛋白激素。抑制素基因由α 亞基和β 亞基通過二硫鍵連接而成，β 亞基包括βA 和βB 兩種形式，α 亞基分別與這兩種亞基結(jié)合形成INHA 和INHB［2，3］。研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物胚胎期、新生動(dòng)物卵巢及成年雌性動(dòng)物卵巢中均可以檢測到抑制素亞基基因的表達(dá)，但抑制素的不同亞基基因表達(dá)的具體時(shí)間和表達(dá)量在不同物種中存在著很大的差異［4］。Robertson DM［5］等認(rèn)為，抑制素可以阻斷促性腺激素釋放激素(GnRH) 受體的合成，也可作為GnRH的阻滯劑，主要阻斷了GnRH 受體后水平的信息傳遞，從而降低了細(xì)胞對GnRH 的反應(yīng)性。而Bicsak［6］等認(rèn)為，抑制素可直接通過調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性來影響垂體FSH 合成。許多試驗(yàn)證明，用不同類型的抑制素免疫原免疫動(dòng)物，均可引起血FSH 水平增加，而對黃體化激素LH 沒有直接作用，被免疫動(dòng)物循環(huán)LH 水平無明顯變化。但也有體外試驗(yàn)表明，豬抑制素制備物可加強(qiáng)綿羊垂體細(xì)胞GnRH 誘導(dǎo)的LH 釋放，而抑制素對GnRH 誘發(fā)的鼠垂體細(xì)胞FSH 和LH 釋放均表現(xiàn)為抑制作用。這說明抑制素對LH 的作用可能存在種間差異。

本研究擬針對上述實(shí)際存在的問題，對新疆多浪羊和卡拉庫爾羊兩個(gè)地方品種利用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行卵巢上INHA 的特異性免疫組織化學(xué)染色分析，希望從中發(fā)現(xiàn)它們的某些分布變化規(guī)律，從而為有針對性地建立不同地方綿羊品種的卵泡發(fā)育體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

在新疆喀什莎車縣，選取健康、發(fā)育良好的未孕雌性多浪羊和卡拉庫爾羊各10 只，2 ～3 歲。屠宰后取卵巢組織，置于4%甲醛固定液中。

1.2 主要試劑

兔抗INHA 抗體，抗兔SP 免疫試劑盒，DAB顯色試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。國產(chǎn)分析純有磷酸緩沖液(PBS) 、加拿大樹脂、檸檬酸緩沖液自配。

1.3 切片標(biāo)本制備

甲醛固定好的卵巢組織修正后梯度濃度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片厚度6～8 μm。

1.4 INHA 免疫組織化學(xué)染色程序

參考王惠娥文獻(xiàn)［7，8］。

1.5 圖像分析

每樣本分別選取5 張陽性切片，并隨機(jī)觀察每張片子的5 個(gè)視野，用image J 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)各級卵泡免疫組化陽性細(xì)胞率(陽性細(xì)胞面積/總細(xì)胞面積) 的均值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用軟件SPSS 12.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用單因子方差分析進(jìn)行結(jié)果的差異顯著性檢驗(yàn)并進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)相關(guān)分析均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下的染色結(jié)果

圖1 抑制素A 在各級卵泡免疫組化定位

2.2 綿羊卵巢中抑制素的定位分布

由圖1 可以看出，免疫組化染色陽性切片背景無色或淡藍(lán)色，抑制素A 免疫反應(yīng)細(xì)胞為黃色或棕黃色; 陽性細(xì)胞的胞質(zhì)中著有黃色或棕黃色反應(yīng)顆粒，蘇木素染成細(xì)胞核為淡藍(lán)色或藍(lán)色。對照組切片染色陰性，背景無色或淡藍(lán)色，無黃色或棕黃色染色，說明免疫組化SP 法分別具有抑制素A 免疫反應(yīng)的特異性。

2.3 卵巢中抑制素免疫反應(yīng)物質(zhì)的分布和圖像分析

光鏡下觀察抑制素A 陽性細(xì)胞主要分布在膜細(xì)胞和卵泡旁血管周圍間質(zhì)中。原始卵泡開始就有抑制素A 陽性物質(zhì)，初級卵泡單層高柱狀的顆粒細(xì)胞胞質(zhì)中可見陽性反應(yīng)。隨著卵泡的發(fā)育，卵泡膜細(xì)胞分化出來后即呈現(xiàn)較高的染色強(qiáng)度，其與卵泡體積大小無關(guān)。初級卵泡和次級卵泡陽性細(xì)胞數(shù)量顯著高于原始卵泡和成熟卵泡(P ＜0.05) 。

表1 卵泡抑制素A 陽性細(xì)胞圖像分析

表2 各級卵泡抑制素A 陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度

由表1 可見，卡拉庫爾羊和多浪羊抑制素A陽性細(xì)胞在卵泡發(fā)育各階段以及成熟卵泡的膜細(xì)胞和血管周圍間質(zhì)都有表達(dá)。初級卵泡和次級卵泡中除了膜細(xì)胞和血管周圍間質(zhì)表達(dá)抑制素A 陽性外，卵母細(xì)胞也有表達(dá)，且隨著卵泡的增大，陽性細(xì)胞表達(dá)率呈先遞增后遞減趨勢?？ɡ瓗鞝栄蚝投嗬搜虺跫墶⒋渭壜雅菀种扑谹 陽性表達(dá)率顯著高于原始卵泡和成熟卵泡(P ＜0.05) 。兩品種間比較，多浪羊各級卵泡抑制素A 陽性細(xì)胞數(shù)均比卡拉庫爾羊高，但差異不顯著(P ＞0.05) 。

由表2 可見，隨卵泡體積增大，陽性膜細(xì)胞數(shù)量增多，卵泡腔出現(xiàn)并逐漸增大至大腔階段。膜細(xì)胞著色強(qiáng)度增強(qiáng)至腔前卵泡隨后減弱，卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞著色強(qiáng)度變化不明顯，細(xì)胞間質(zhì)可見陽性染色強(qiáng)度。

3 討論

3.1 抑制素在綿羊卵巢中的定位研究

目前國內(nèi)外有關(guān)綿羊抑制素的研究，主要側(cè)重編碼其各自相應(yīng)蛋白產(chǎn)物的基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)變化，而利用免疫組化技術(shù)檢測其各自相應(yīng)蛋白產(chǎn)物表達(dá)變化的報(bào)道相對較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明抑制素陽性物質(zhì)主要分布于卵泡膜細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)，而顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞中分布較少或沒有分布。

3.2 抑制素基因在兩個(gè)綿羊品種間卵巢中相對表達(dá)量

抑制素會(huì)對卵泡發(fā)育、分化和成熟及排卵的過程起作用。卵泡發(fā)育是一個(gè)以形態(tài)變化為特征的生長過程，同時(shí)伴隨著卵泡功能的分化，原始卵泡經(jīng)過發(fā)育和分化后，可形成優(yōu)勢卵泡，使卵子成熟和排出，也可中途閉鎖。抑制素可通過自分泌及旁分泌對卵泡的正常生長分化及閉鎖起到刺激或抑制卵泡優(yōu)勢化過程中，抑制素?cái)?shù)量逐漸增高。研究表明，在成年動(dòng)物，抑制素水平在動(dòng)情周期的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中變化最為明顯，這說明優(yōu)勢卵泡的選擇與抑制素表達(dá)有很大關(guān)系。Abdennebi［5］等通過對多胎的羅曼諾夫綿羊和單胎的法蘭西島綿羊研究發(fā)現(xiàn)，在小的有腔卵泡中，抑制素在顆粒細(xì)胞中有清晰的表達(dá)，但在卵細(xì)胞中，僅檢測到低水平的抑制素，在大的有腔卵泡中，抑制素水平在內(nèi)膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均有高度的表達(dá)。

由表1 和圖1 可以看出，多浪羊和卡拉庫爾羊初級卵泡和次級卵泡抑制素陽性表達(dá)率顯著高于(P ＜0.05) 原始卵泡和成熟卵泡。隨著卵泡發(fā)育，抑制素陽性細(xì)胞率呈遞增趨勢，直至腔前卵泡達(dá)到最高峰，隨之卵泡成熟而下降。各級卵泡抑制素的表達(dá)量多浪羊均比卡拉庫爾羊表達(dá)量高，但差異不顯著(P ＞0.05) 。該結(jié)果與Abdennebi［5］等的結(jié)果相一致。他們通過對高產(chǎn)的ROM 羊和低產(chǎn)IF 羊的研究也發(fā)現(xiàn)，在大的成熟卵泡的顆粒細(xì)胞中，僅檢測到低水平的抑制素，在小的有腔卵泡中，抑制素水平在顆粒細(xì)胞中有高度的表達(dá)。金萱［9］等研究發(fā)現(xiàn)，出生后5 d 的大鼠所分化的顆粒細(xì)胞中開始INHA 亞基基因表達(dá)，隨后逐漸增加至竇狀卵泡期達(dá)到高峰，健康的卵泡顆粒細(xì)胞中INHA 的活性強(qiáng)而卵母細(xì)胞中tPA 活性弱; 閉鎖卵泡卵母細(xì)胞中tPA 活性高，其顆粒細(xì)胞表達(dá)的INHA 的mRNA 活性較弱，說明顆粒細(xì)胞表達(dá)的抑制素A 與卵母細(xì)胞tPA 活性存在密切關(guān)系。說明在卵泡優(yōu)勢化過程中，抑制素起著非常重要的作用。抑制素作用于除了優(yōu)勢卵泡以外的其他卵泡，抑制其發(fā)育成熟，使其閉鎖，從而使優(yōu)勢卵泡能夠發(fā)育成熟并排卵。

4 結(jié)論

多浪羊與卡拉庫爾羊的抑制素陽性物質(zhì)主要見于膜細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)。多浪羊與卡拉庫爾羊在其初級卵泡和次級卵泡中抑制素的表達(dá)陽性率都顯著高于其原始卵泡和成熟卵泡(P ＜0.05) 。且隨著卵泡的不斷增大，抑制素水平在腔前卵泡之前達(dá)到高峰，隨后下降。因此，這可能與卵泡優(yōu)勢化有關(guān)，進(jìn)而與多胎性有關(guān)。

［1］郭淑華.相關(guān)分子在哺乳動(dòng)物原始卵泡啟動(dòng)和生長中的作用［J］.濰坊學(xué)院學(xué)報(bào).2010，(06).

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［4］趙中權(quán).抑制素對山羊繁殖力的影響［M］.特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng).2011.

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［7］王惠娥，汪瀾，尼亞孜布.卡拉庫爾羊卵巢中促性腺激素受體蛋白的分布［J］.畜牧與獸醫(yī).2013.(09).

［8］王惠娥，汪瀾，盛偉明.免疫組化法檢測促黃體素受體在多浪羊和卡拉庫爾羊卵巢上的分布［J］.中國畜牧獸醫(yī).2013.(03).

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