李小軍

(河南省濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 濟(jì)源 459000)

新孢子蟲可感染多種動(dòng)物，其危害最為嚴(yán)重的中間宿主是牛。目前檢測(cè)牛新孢子蟲抗體的血清學(xué)方法主要包括ELISA、IFAT、凝集試驗(yàn)以及Westernblot試驗(yàn)等。ELISA具有較高的特異性、穩(wěn)定性，操作方法簡(jiǎn)便，易于掌握，可用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。因此，本實(shí)驗(yàn)采用間接ELISA，對(duì)采集的奶牛血清進(jìn)行新孢子蟲陽性檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器設(shè)備

1.1.1 主要試劑：備檢血清（濟(jì)源采集分離如表1-1所示，河科大保存），新孢子蟲間接ELISA試劑盒（其主要成分如表1-2所示）

1.1.2 儀器設(shè)備：冰箱，臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱，酶標(biāo)檢測(cè)儀，微量移液器等。

表1-1 備檢血清樣本數(shù)及來源

1.2 血樣采集和血清分離

1.2.1 血樣采集：在流產(chǎn)率較高的6個(gè)奶牛場(chǎng)（區(qū)）中，采集有流產(chǎn)史的母牛血樣。用牛尾靜脈采血，每頭5 mL左右。做好樣品的編號(hào)和詳細(xì)記錄母牛信息。

1.2.2 血清的分離與保存：血液樣品平放37℃恒溫箱2h，放入4℃冰箱過夜，離心機(jī)2000～3000r/min離心5～10min，離心管上層清液即為血清。用移液器收集于干燥的離心管中，貼上標(biāo)簽保存于-20℃冰箱中備用。

表1-2 新孢子蟲間接ELISA試劑盒

2 血清ELISA 檢測(cè)

2.1 試劑盒保存

ELISA試劑盒開封前避光存放于4℃冰箱中，包被板密封防潮。從冰箱取出后在室溫條件下放置一段時(shí)間，方可使用。

2.2 血清檢測(cè)

2.2.1 溶液的配制：試劑盒中所用稀釋液為含1%BSA的PBS，洗滌液為含0.05%PBST的蒸餾水或去離子水，充分混勻即可，每次試驗(yàn)現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2.2 將待檢血清用含1%BSA的PBS按1:100的比例進(jìn)行稀釋，每孔100μL，37℃孵育1個(gè)小時(shí)。

2.2.3 編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽性對(duì)照2孔、空白對(duì)照2孔。

2.2.4 洗滌：甩去酶標(biāo)反應(yīng)板內(nèi)液體，然后用配好的0.05%PBST洗滌液，每孔加300μL，室溫靜置3min，在吸水紙上拍干，反復(fù)洗滌三遍。

2.2.5 將二抗按1:22000的比例進(jìn)行稀釋，每孔加100μL，37℃孵育1h。

2.2.6 洗滌同步驟2。

2.2.7 顯色：將A液和B液1:1現(xiàn)配制（避光），每孔加100 μL，37℃避光放置15 min。

2.2.8 終止反應(yīng)：每孔加終止液50μL，終止液為2mol/L硫酸。

2.2.9 終止液加完后，應(yīng)立即在酶標(biāo)儀上于OD450、OD630檢測(cè)。

2.3 結(jié)果判定

2.3.1 Cut-off值（COV）=陰性對(duì)照平均OD值×2.1（陰性對(duì)照孔OD值＜0.08時(shí)按0.08計(jì)）。

2.3.2 有效判定：空白對(duì)照孔OD值＜0.05（若大于0.05則實(shí)驗(yàn)無效），陰性對(duì)照孔OD值≤0.10（若大于0.10則實(shí)驗(yàn)無效），陽性對(duì)照孔OD值≥1.0（若小于1.0則實(shí)驗(yàn)無效）。

2.3.3 樣本OD值≥COV值時(shí)，判為新孢子蟲抗體陽性；

3 結(jié)果

3.1 濟(jì)源市奶牛新孢子蟲感染情況

表1-3 濟(jì)源市新孢子蟲抗體檢測(cè)結(jié)果

由表1-3可知，198份血清樣本中，新孢子蟲抗體陽性率高達(dá)44.44%。

3.2 血清樣本檢測(cè)結(jié)果

表1-4 血清樣本檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)果分類比對(duì)

4.1 不同飼養(yǎng)環(huán)境與陽性率之間的關(guān)系

表1-5 飼養(yǎng)環(huán)境與新孢子蟲抗體陽性率的關(guān)系

由表1-5可知，在不同飼養(yǎng)環(huán)境中，奶牛新孢子蟲抗體陽性率存在差異性，經(jīng)卡方檢驗(yàn)計(jì)算x2=0.58，P＞0.05，差異不顯著。

4.2 流產(chǎn)奶牛與正常奶牛之間新孢子蟲陽性率之間的關(guān)系

表1-6 流產(chǎn)奶牛與正常奶牛之間新孢子蟲抗體陽性率之間的關(guān)系

由表1-6可知，在流產(chǎn)奶牛與正常奶牛中，新孢子蟲抗體陽性率存在差異性，經(jīng)卡方檢驗(yàn)計(jì)算x2=4.15，0.01

4.3 不同年齡段與新孢子蟲抗體陽性率之間的關(guān)系

表1-7 不同年齡段與奶牛新孢子蟲抗體陽性率之間的關(guān)系

由表1-7可知，不同年齡段新孢子蟲抗體陽性率存在差異性，經(jīng)卡方檢驗(yàn)計(jì)算x2=2.77，P>0.05，差異不顯著。

5 討論

5.1 濟(jì)源奶牛新孢子蟲感染率與其它地方比較

本試驗(yàn)對(duì)濟(jì)源奶牛進(jìn)行新孢子蟲流行病學(xué)調(diào)查，陽性率為44.44%。馬利青調(diào)查，陽性率為4.35%；張昌盛等報(bào)道的北京地區(qū)陽性率18.1%(17/94)；于晉海等調(diào)查，陽性率為17.2%；鄒世穎等調(diào)查，陽性率平均為8.6%；濟(jì)源奶牛新孢子蟲感染率要遠(yuǎn)高于其它地區(qū)。