薛發(fā)珍

摘 要：這項(xiàng)生產(chǎn)工藝是本課題大量實(shí)驗(yàn)的相關(guān)成果，借鑒法國(guó)公司依諾肝素鈉生產(chǎn)情況，采用一種原材料，經(jīng)過(guò)科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)纳a(chǎn)過(guò)程，所研制的依諾肝素鈉樣品符合歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，文章總結(jié)了生產(chǎn)過(guò)程中需要重視的環(huán)節(jié)，使這種藥品國(guó)產(chǎn)化成為可能。

關(guān)鍵詞：依諾肝素鈉；生產(chǎn)；酯化率；成環(huán)率；純化

藥品依諾肝素鈉（enoxaparin sodium）是一種低分子肝素藥物，這種藥品是治療預(yù)防與腦血栓的最佳藥品之一，具有抗血栓作用強(qiáng)、出血危險(xiǎn)性小等特征，經(jīng)臨床試驗(yàn)表明，依諾肝素鈉能達(dá)到抗凝血、抗血栓形成的顯著療效，故此，這種藥品具有重要的醫(yī)療價(jià)值，對(duì)生物制藥企業(yè)而言，大面積生產(chǎn)這種藥品，能帶來(lái)大量的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)也能滿足我國(guó)的醫(yī)療需求。

1 依諾肝素鈉的生產(chǎn)工藝

1.1 依諾肝素鈉現(xiàn)行的生產(chǎn)工藝

依諾肝素鈉主要特征為分子中有一個(gè)4-烯吡喃糖醛酸結(jié)構(gòu)（圖1）。目前，醫(yī)療上使用的依諾肝素鈉都由法國(guó)Aventis公司研發(fā)，并由這家公司在1993年申請(qǐng)專利。由于這項(xiàng)專利未涉及生產(chǎn)過(guò)程中酯化率、成環(huán)率及產(chǎn)物純化等關(guān)鍵工藝，因此存在一定的缺陷，這就使得法國(guó)這家公司運(yùn)用該專利生產(chǎn)的藥物樣品時(shí)，距離歐洲藥典4.0版規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)尚有一定的距離。

1.2 這項(xiàng)生產(chǎn)工藝的研究目的

這項(xiàng)研究主要是通過(guò)對(duì)相關(guān)反應(yīng)條件的控制，研制出可以實(shí)現(xiàn)流水線生產(chǎn)依諾肝素鈉的生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)出來(lái)的樣品，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，表明這些樣品的溶液顏色符合歐洲藥典4.0版要求，其余質(zhì)量指標(biāo)均符合歐洲藥典5.3版。

1.3 這項(xiàng)工藝所需的儀器與試劑

根據(jù)生產(chǎn)過(guò)程的相關(guān)要求，結(jié)合前期的研究情況，這項(xiàng)工藝所需的儀器、設(shè)備和試劑，有如下幾種：1100型高效液相色譜儀、TSK-GEL 凝膠色譜柱及1100型示差檢測(cè)儀均為Agilent產(chǎn)品；UV-2101PC型紫外檢測(cè)儀（日本島津）。肝素鈉（南京健友公司）；芐索氯銨[benz e thoniumchloride，化學(xué)名為芐基二甲基[2-[2-[4-（1，1，3，3-四甲基丁基）苯氧基]乙氧基]乙基]氯化銨，Sigma公司]；二氯甲烷、氯芐（上海三愛(ài)思試劑有限公司）；H103型非極性大孔聚苯乙烯吸附樹(shù)脂（南開(kāi)大學(xué)化工廠，柱徑3.6cm，柱床體積550ml）；依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品（歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)品）；其他試劑均為分析純。

2 依諾肝素鈉的生產(chǎn)過(guò)程

根據(jù)課題組的大量實(shí)驗(yàn)，依諾肝素鈉的生產(chǎn)過(guò)程包括如下幾個(gè)步驟。

2.1 合成肝素芐索氯銨鹽

取肝素鈉10g，加水50ml溶解；取芐索氯銨25g溶于水100ml中，攪拌下將其緩慢加至肝素鈉溶液中，過(guò)濾。濾餅用水洗滌，烘干，得肝素芐索氯銨鹽31.2g。

2.2 合成肝素芐基酯

取肝素芐索氯銨鹽30g，加二氯甲烷150ml攪拌溶解后，緩慢滴加氯芐31.5ml，35℃反應(yīng)25h。反應(yīng)完畢加入溶有醋酸鈉18g的甲醇180ml，待沉淀析出后，過(guò)濾。濾餅用甲醇洗滌，干燥，得肝素芐基酯10.5g。

2.3 配制堿性溶液，解聚制成品

取肝素芐基酯30g，溶于水900ml中，加熱至62℃，加入氫氧化鈉4.5g，攪拌解聚1h。反應(yīng)完畢，冷卻，用鹽酸調(diào)至pH 6.0，加氯化鈉90g使其終濃度為10%。邊攪拌邊加甲醇2.7L，析出沉淀過(guò)濾。濾餅用甲醇洗滌，減壓干燥，得黃褐色依諾肝素鈉粗品20g。

2.4 對(duì)粗品進(jìn)行純化

取依諾肝素鈉的粗品23g，加水溶解得5%溶液，加入活性炭，攪拌，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至濃度為25%（w/v）。將依諾肝素鈉濃縮液上非極性大孔聚苯乙烯吸附樹(shù)脂柱，用水洗脫，收集目標(biāo)峰。收集液（約460ml）中加入3倍體積乙醇沉淀依諾肝素鈉，過(guò)濾，濾餅加適量水溶解后冷凍干燥，得依諾肝素鈉成品18.8g?？偸章蕿?0%。

2.5 檢測(cè)制成品

首先，精密稱取依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品5mg，溶于0.2mol/L硫酸鈉溶液（pH5.0）0.5ml，配制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液；其次，精密稱取依諾肝素鈉 10mg，溶于0.2mol/L硫酸鈉（pH5.0）溶液1ml，配制成供試品溶液。樣品檢測(cè)需要的色譜條件是：色譜柱TSK-GEL凝膠色譜柱（7.8mm×300mm，5μm），流動(dòng)相 0.2mol/L硫酸鈉溶液（用稀硫酸調(diào)至pH5.0），流速0.5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)234nm進(jìn)樣量25μl。所得數(shù)據(jù)用高效液相色譜儀自帶的Excel軟件計(jì)算。然后，開(kāi)始檢測(cè)，取依諾肝素鈉和依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紅外和核磁共振研究。依諾肝素鈉樣品的紅外特征吸收峰和核磁共振圖譜均和標(biāo)準(zhǔn)品一致。依諾肝素鈉按歐洲藥典5.3版下方法檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。另精密稱取依諾肝素鈉，按歐洲藥典5.3版下方法進(jìn)行溶液比色，結(jié)果略深于6號(hào)色，但淺于歐洲藥典4.0版規(guī)定的5號(hào)色。

3 研究結(jié)論

根據(jù)課題組大量的前期實(shí)驗(yàn)，根據(jù)這項(xiàng)生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)方法，制造出來(lái)的依諾肝素鈉制品，完全達(dá)到歐洲藥典4.0版的標(biāo)準(zhǔn)要求，而且比法國(guó)公司的制成品要稍勝一籌，這就意味著這種藥品的國(guó)產(chǎn)化已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)可能，必將降低消費(fèi)者的相關(guān)醫(yī)療開(kāi)支，給消費(fèi)者帶來(lái)了福利，同時(shí)也會(huì)為我國(guó)相關(guān)生物制藥企業(yè)帶來(lái)潛在的商機(jī)。

根據(jù)前期的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，依諾肝素鈉制成樣品的質(zhì)量情況和臨床療效，根據(jù)控制酯化率、控制成環(huán)率、樣品的純化有著直接的關(guān)系，生產(chǎn)過(guò)程中，如果著重注意上述三個(gè)環(huán)節(jié)，制成樣品一定能達(dá)到滿意的情況。控制酯化率的過(guò)程中，酯化率越高，解聚產(chǎn)物的平均分子量越低，只有當(dāng)酯化率為12%～13%時(shí)，產(chǎn)物的分子量符合歐洲藥典5.3版的標(biāo)準(zhǔn)。因此，必須通過(guò)一些程序來(lái)降低制成品的酯化率。一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，酯化率一般通過(guò)反應(yīng)溫度和時(shí)間來(lái)控制。反應(yīng)溫度越高，時(shí)間越長(zhǎng)，酯化率越高。其次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)，制成品成環(huán)率的控制，主要在于聚集時(shí)間的控制，解聚時(shí)間為1小時(shí)左右，可使最終產(chǎn)物中1，6-脫水結(jié)構(gòu)單元的含量符合歐洲藥典5.3版的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于制成品中出現(xiàn)的一些有色雜質(zhì)，利用活性炭和大孔吸附樹(shù)脂組合法對(duì)制成品進(jìn)行脫色，可有效分離有色雜質(zhì)，使得成品大部分指標(biāo)符合歐洲藥典5.3版的標(biāo)準(zhǔn)。只要我國(guó)醫(yī)藥企業(yè)積極采用這項(xiàng)生產(chǎn)工藝，在生產(chǎn)過(guò)程中重視這三個(gè)環(huán)節(jié)的實(shí)時(shí)控制，一定能大批量生產(chǎn)出滿足臨床要求的依諾肝素鈉藥品。

參考文獻(xiàn)

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