楊　丹，王　麗，李　珠，劉趙陽，劉　暢，郭　麗，付　佳，祁　榮，王俊平

(沈陽醫(yī)學(xué)院1.藥理學(xué)教研室、2.科學(xué)實驗中心，遼寧沈陽　110034)

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棉酚通過Akt/β-catenin通路抑制胃癌細(xì)胞遷移

楊丹1，王麗1，李珠1，劉趙陽1，劉暢1，郭麗2，付佳2，祁榮2，王俊平1

(沈陽醫(yī)學(xué)院1.藥理學(xué)教研室、2.科學(xué)實驗中心，遼寧沈陽110034)

摘要:目的探討棉酚(gossypol)對胃癌細(xì)胞遷移能力的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。方法胃癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度棉酚處理后，MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移能力，Western blot法檢測絲/蘇氨酸激酶/β-鏈蛋白(Akt/β-catenin)信號通路活性及相關(guān)蛋白細(xì)胞周期蛋白D1 (cyclin D1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果

MTT實驗顯示，棉酚對胃癌細(xì)胞具有增殖抑制作用，且隨濃度增加而增大; Transwell小室實驗顯示棉酚對胃癌細(xì)胞遷移能力具有抑制作用;棉酚對胃癌細(xì)胞遷移能力的抑制率高于增殖抑制率;與對照組相比，棉酚可明顯下調(diào)胃癌細(xì)胞的p-Akt、β-catenin、cyclin D1、MMP-2和vimentin蛋白表達(dá)水平，明顯上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)水平。結(jié)論棉酚通過下調(diào)Akt/β-catenin通路活性抑制胃癌細(xì)胞遷移。

關(guān)鍵詞:棉酚;胃癌;絲/蘇氨酸激酶;β-鏈蛋白;細(xì)胞周期蛋白D1;基質(zhì)金屬蛋白酶-2; E-鈣黏蛋白;波形蛋白

胃癌作為當(dāng)今世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率占消化道腫瘤的40%～50%，在我國胃癌死亡率為各種癌癥之首，多數(shù)患者在就診時己經(jīng)處于進(jìn)展期，預(yù)后較差，5年生存率不足10%［1］。轉(zhuǎn)移作為胃癌進(jìn)展期重要特點之一，是胃癌治療所面臨最大障礙，因此迫切需要研究防治胃癌轉(zhuǎn)移的藥物和方法，改善患者的預(yù)后。

棉酚是從錦葵科植物成熟種子、根皮中提取的一種黃色多元酚類物質(zhì)，作為口服男用避孕藥及治療婦科疾病應(yīng)用于臨床。自上世紀(jì)80年代起諸多研究表明，棉酚及其衍生物具有明顯的抗腫瘤作用，并具有多重機(jī)制、不良反應(yīng)小等優(yōu)點，故有很大的研究價值［2］。目前研究多為觀察其影響腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，關(guān)于其對腫瘤細(xì)胞遷移能力影響的報道較少見［3－4］。

本研究擬采用Transwell小室法檢測棉酚對胃癌細(xì)胞遷移能力的抑制作用，同時檢測胞內(nèi)Akt/βcatenin信號通路活性及相關(guān)蛋白cyclin D1、MMP-2、E-cadherin和vimentin表達(dá)的變化，從分子水平探討其抑制人胃癌細(xì)胞遷移能力的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料棉酚和溴化四氮唑藍(lán)(MTT) (Sigma公司) ; RPMI 1640培養(yǎng)基及胰酶(Gibco公司) ;新生牛血清(FBS) (杭州四季青公司) ;化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(Pierce公司) ; Transwell小室(Costar公司) ; cyclin D1、MMP-2、β-actin抗體(Santa Cruz公司) ; p-Akt、β-catenin、E-cadherin和vimentin抗體(CST公司) ; NC膜(Millipore公司) ;多聚甲醛、結(jié)晶紫均為國產(chǎn)分析級產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌MGC-803和MKN1細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫提供。將細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，用RPMI 1640培養(yǎng)基+10% FBS培養(yǎng)，1～2 d更換培養(yǎng)液1次，每2～3天傳代1次，實驗時選用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3MTT比色法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升5 ×104個細(xì)胞，體積為100 μL，接種于96孔板內(nèi)，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。加入含棉酚培養(yǎng)液(終濃度分別為50、25、12.5、6.25 μmol·L－1)，同時設(shè)立正常對照組，空白組不加細(xì)胞，只加RPMI 1640培養(yǎng)基。體外培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT (終濃度5 g·L－1)，37℃繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO振蕩10 min，于490 nm測定吸光度值(A)，實驗重復(fù)3次。依下列公式計算細(xì)胞存活率/%=(A實驗組－A空白組)/(A對照組－A空白組)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.4Transwell小室實驗用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞濃度為每毫升5×104個的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液200 μL，培養(yǎng)基中分別加入終濃度0、2.5、5、10 μmol ·L－1的棉酚，加入上室中，并在下室中加入600 μl 含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，取出小室用無菌棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，多聚甲醛固定10 min; 0.1%結(jié)晶紫染色液室溫染色20 min，清水漂洗3遍; Transwell小室翻過來，底面朝上置鏡下觀察小室穿膜細(xì)胞數(shù)，每個小室取5個視野。細(xì)胞遷移抑制率/%=(對照組遷移細(xì)胞數(shù)－棉酚組遷移細(xì)胞數(shù))/對照組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.5Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)變化提取經(jīng)0、2.5、5、10 μmol·L－1的棉酚處理24 h后細(xì)胞總蛋白，離心后取上清經(jīng)Lowry法蛋白定量后電泳，完畢后將樣品轉(zhuǎn)移至NC膜上，封閉1 h，分別加入p-Akt抗體(1∶500)、β-catenin抗體(1∶500)、cyclin D1抗體(1∶500 )、E-cadherin抗體(1∶500)、vimentin抗體(1∶500)、MMP-2抗體(1∶200)、β-actin抗體(1∶1 000)，4℃過夜。漂洗后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶1 000)室溫孵育0.5 h，TBST洗膜4次，用化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)照像，并利用Image J軟件對目的條帶進(jìn)行灰度值檢測，以β-actin為內(nèi)參照分析蛋白相對表達(dá)量。所有結(jié)果都被至少重復(fù)3次。

Fig 1 Inhibition of migration of gastric carcinoma cells by gossypol

2　結(jié)果

2.1棉酚對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用以0、6.25、12.5、25、50 μmol·L－1棉酚分別處理細(xì)胞24、48、72 h后，采用MTT法檢測各組吸光度，計算棉酚對MGC-803細(xì)胞和MKN1細(xì)胞的增殖抑制率。與對照組比較，棉酚對兩種胃癌細(xì)胞均有抑制作用。在一定范圍內(nèi)，隨著棉酚濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用增強(qiáng)(Tab 1)。棉酚作用24、48、72 h抑制胃癌細(xì)胞增殖50%的藥物濃度(IC50)見Tab 2。2.2棉酚對胃癌細(xì)胞遷移能力的抑制作用采用Transwell小室法檢測以小于72 h的IC50濃度的棉酚(0、2.5、5、10 μmol·L－1)分別處理MGC-803細(xì)胞和MKN1細(xì)胞24 h后對細(xì)胞遷移能力的影響，以5-氟尿嘧啶(2 mg·L－1)做為陽性對照組。由MTT實驗結(jié)果可知，以上濃度的棉酚作用24 h對MGC-803細(xì)胞和MKN1細(xì)胞增殖影響極小，故在判斷此濃度藥物對細(xì)胞遷移能力影響時可排除藥物對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，5-氟尿嘧啶組、5和10 μmol·L－1棉酚組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) (Tab 3、Fig 1)。

2.3棉酚對胃癌MKN1細(xì)胞Akt/β-catenin通路活性及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響分別以0、2.5、5、10 μmol·L－1棉酚處理胃癌MKN1細(xì)胞24 h后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)隨著棉酚濃度的增加，細(xì)胞總蛋白的p-Akt、β-catenin、cyclin Dl、MMP-2和vimentin的蛋白表達(dá)下降，而E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) (Fig 2)。

Tab 1 Effects of gossypol on gastric carcinoma cells proliferation(±s，n=3)

Tab 1 Effects of gossypol on gastric carcinoma cells proliferation(±s，n=3)

*P＜0.05 vs control

Gossypol/Cell survival rate/% μmol·L－124 h MG 4 C8 - 8h 0 3 72 h24 h M4 K8 N h 1　72 h 0 100±0.00　100±0.00　100±0.00　100±0.00　100±0.00　100±0.00 6.25　100±0.41　93.81±18.47*　91.19±5.87*　99.08±0.40　95.23±34.89*　94.67±3.75*12.5　94.70±2.86*　71.34±12.71*　65.60±3.31*　82.51±1.84*　70.82±3.74*　53.52±10.12*25　69.26±14.26*　24.64±1.61*　16.50±1.51*　76.56±3.36*　24.12±5.47*　8.36±6.51*50　5.01±2.71*　3.72±1.20*　3.20±0.60*　38.78±2.33*　11.04±1.16*　2.85±1.28*

Tab 2　IC50of inhibitory effect of gossypol on gastriccarcinoma cells proliferation(±s，n=3)

Tab 2　IC50of inhibitory effect of gossypol on gastriccarcinoma cells proliferation(±s，n=3)

IC/μmol·L－1Cell line　5024 h　48 h　72 h MGC-803　29.39±3.74　17.22±2.69　15.22±0.99 MKN1　39.67±3.92　17.23±1.35　13.07±0.99

Tab 3 Inhibition of migration of gastric carcinoma cells by gossypol(±s，n=3)

Tab 3 Inhibition of migration of gastric carcinoma cells by gossypol(±s，n=3)

*P＜0.05 vs control

Group Number of cells migration MGC-803　MKN1 Control　165.42±25.65　188.26±57.02 Gossypol/μmol·L－1　2.5 ? 152.22±14.56　140.02±18.855　126.13±7.81*　64.57±26.06*10　67.56±25.10*　32.59±20.69*5-FU/mg·L－1　2　85.16±16.25*　82.62±20.11*

Fig 2 Effects of activation of Akt/β-catenin pathwayand expression of related proteins in MKN1 cells after treated by gossypol

3　討論

本研究顯示棉酚具有抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移的作用，且對胃癌細(xì)胞遷移能力的抑制率高于增殖抑制率，說明大量細(xì)胞在死亡之前就已經(jīng)喪失遷移能力，此結(jié)果提示棉酚在胃癌?惡性轉(zhuǎn)移方面可能發(fā)揮有效的治療作用。

Akt是多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵中樞效應(yīng)蛋白。磷酸化的Akt激活其下游分子，與腫瘤的運(yùn)動、侵襲與轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，抑制Akt的活化可以降低多種腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［5］。β-catenin是一種分子量為90 ku多功能蛋白質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)可存在于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中。β-catenin能與多種蛋白相互作用，如E-cadherin、淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子(LEF/TCF)、α-連環(huán)鏈蛋白等，參與Wnt信號通路和細(xì)胞間黏附、腫瘤轉(zhuǎn)移等過程［6］。Akt活性增加能夠增加β-catenin在腫瘤細(xì)胞中的濃度，促進(jìn)βcatenin蛋白入核及轉(zhuǎn)錄活性，從而加快腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［7］。故為了進(jìn)一步探討棉酚抑制胃癌細(xì)胞遷移作用的分子機(jī)制，本研究選擇Akt/β-catenin為研究的切入點。結(jié)果顯示，棉酚明顯降低了胃癌細(xì)胞中p-Akt和β-catenin蛋白表達(dá)，說明棉酚抑制胃癌細(xì)胞遷移作用可能與其抑制Akt/β-catenin信號通路活性有關(guān)。

為進(jìn)一步明確棉酚對胃癌細(xì)胞Akt/β-catenin信號通路抑制作用與其抑制胃癌細(xì)胞遷移作用的相關(guān)性，本研究檢測了棉酚對幾種Akt/β-catenin信號?通路下游和腫瘤細(xì)胞遷移能力相關(guān)蛋白(E-cadherin、vimentin、cyclin D和MMP-2)表達(dá)的影響。

E-cadherin是上皮細(xì)胞中的一類依賴Ca2+的細(xì)胞黏著跨膜糖蛋白，位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)β-catenin大部分與胞膜上E-cadherin的胞質(zhì)端相連構(gòu)成E-cadherin/β-catenin復(fù)合物，與細(xì)胞骨架相連，介導(dǎo)細(xì)胞間黏附連接，以維持上皮細(xì)胞的極性、完整性和細(xì)胞間黏附的穩(wěn)定性［8］。Akt能夠抑制E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄，而E-cadherin表達(dá)水平的下降可使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積聚，并促進(jìn)其入核，進(jìn)一步激活下游基因的轉(zhuǎn)錄［9］。

MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶類中的重要一員，具有很強(qiáng)的降解基底膜成份能力，被認(rèn)為是與腫瘤的惡性進(jìn)程、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的一類明膠酶，是細(xì)胞遷移能力增加的標(biāo)志蛋白，體外研究顯示抑制MMP-2的活性可以阻滯腫瘤細(xì)胞遷移［10－11］。已有多項研究表明，Wnt/β-catenin信號通路活化可提高M(jìn)MP-2的表達(dá)［12］。cyclin D1是Wnt/β-catenin信號通路下游蛋白，Wnt/β-catenin信號通路能夠促進(jìn)cyclin D1的表達(dá)［13］。有多項研究都表明，cyclin D1的表達(dá)與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制cyclin D1表達(dá)后能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤、遷移。

Vimentin為細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白中間絲蛋白的Ⅲ型，現(xiàn)在越來越多的資料表明，vimentin參與腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移、侵襲等過程，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。Vimentin可以介導(dǎo)細(xì)胞移動相關(guān)骨架蛋白的重組，高表達(dá)vimentin的細(xì)胞具有高侵襲能力，抑制vimentin的表達(dá)可以降低癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，vimentin基因敲除鼠創(chuàng)傷愈合速度非常緩慢［14］。這些資料均表明vimentin參與上皮細(xì)胞的遷移過程。Vimentin的表達(dá)水平受β-catenin表達(dá)水平的調(diào)控，β-catenin/T細(xì)胞因子(β-catenin/TCF)復(fù)合物能激活vimentin啟動子，敲低β-catenin表達(dá)能引起vimentin的表達(dá)下降［15－16］。

本研究結(jié)果顯示，棉酚能夠明顯降低胃癌MGC-803細(xì)胞和MKN1細(xì)胞MMP-2、vimetin和cyclin D1蛋白表達(dá)，而上調(diào)E-cadherin表達(dá)水平，這與其下調(diào)Akt/β-catenin通路活性而抑制胃癌細(xì)胞遷移能力一致。

有研究顯示，E-cadherin和vimentin均可通過不同作用機(jī)制影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程。Vimentin通過與p53蛋白結(jié)合，減少p53入核數(shù)量，減少促凋亡因子(如Bad、caspase等)的釋放等作用而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［17－18］。而E-cadherin通過上調(diào)Bcl-2或其他抗凋亡蛋白的表達(dá)而產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡作用［19－20］。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)以對細(xì)胞增殖無明顯影響的較低濃度的棉酚處理胃癌細(xì)胞表現(xiàn)為vimentin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，說明此時E-cadherin和vimentin可產(chǎn)生抑制胃癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移的作用，這可能與較低濃度的棉酚表現(xiàn)出對胃癌細(xì)胞遷移能力的抑制率高于增殖抑制率有關(guān)。

綜上，本研究表明棉酚可抑制胃癌細(xì)胞遷移能力，其作用機(jī)制與抑制Akt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路活性，進(jìn)而影響其下游腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子MMP-2、vimetin、cyclin D1和E-cadherin的蛋白表達(dá)相關(guān)。

(致謝:本文實驗在沈陽醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心完成。)

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Inhibitory effect of gossypol on migration of gastric carcinoma cell lines through Akt/β-catenin passway

YANG Dan1，WANG Li1，LI Zhu1，LIU Zhao-yang1，LIU Chang1，GUO Li2，F(xiàn)U Jia2，QI Rong2，WANG Jun-ping1
(1.Dept of Pharmacology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China; 2.Central Laboratory，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China)

Abstract:AimTo investigate the inhibitory effects of gossypol on migration in gastric carcinoma cell lines and its mechanisms.MethodsGastric carcinoma cells were treated with gossypol at different concentrations.The effects of gossypol on cells proliferation were measured using the MTT assay.The migration of gastric carcinoma cells was detected by transwell assay.The activation of Akt/β-catenin pathway and the expressions of pathway related proteins (p-Akt，β-catenin，cyclin D1，MMP-2，E-cadherin and vimentin) were detected by Western blot.ResultsGossypol treatment could significantly inhibit the proliferation of gastric carcinoma cells in a dose-dependent manner.Transwell assay showed that the migration ability of gastric carcinoma cells was significantly decreased.The inhibitory effect of gossypol on cells migration was more significant than the effect of gossypol on cells proliferation.Compared with the control group，treatment with gossypol significantly suppressed the expressions of p-Akt，β-catenin，cyclin D1，MMP-2 and vimentin protein，whereas the expression of E-cadherin was significantly up-regulated in gastric carcinoma cells in a dose-dependent manner.ConclusionThese results demonstrate that gossypol represses cell migration of gastric carcinoma cells through the down-regulation of the activity of Akt/β-catenin pathway.

Key words:gossypol; gastric carcinoma; Akt;β-catenin; cyclin D1; MMP-2; E-cadherin; vimentin

作者簡介:楊丹(1978－)，女，碩士，講師，研究方向:腫瘤藥理學(xué)，E-mail: 114877789@ qq.com;王俊平(1968－)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤的靶向治療，通訊作者，E-mail: 413742234@ qq.com

基金項目:沈陽市科技計劃項目(No F10-191-8-00)

收稿日期:2015－02－01，修回日期:2015－03－09

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0860－05中國圖書分類號: R329.24; R735.202.2; R977.6; R979.1

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.024