肖志剛, 李 杰, 王 鵬, 李 哲

(1.沈陽師范大學 糧食學院, 沈陽 110034; 2.東北農業(yè)大學 食品學院, 哈爾濱 150030;3.中糧肉食(山東)有限公司, 山東 濰坊 261000)

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擠壓超聲聯(lián)用提取的米糠多糖分離純化研究

肖志剛1,2, 李 杰3, 王 鵬1,2, 李 哲2

(1.沈陽師范大學 糧食學院, 沈陽 110034; 2.東北農業(yè)大學 食品學院, 哈爾濱 150030;3.中糧肉食(山東)有限公司, 山東 濰坊 261000)

以米糠多糖粗液為原料,采用乙酸鋅-亞鐵氰化鉀法、TCA法和Sevag法3種方法脫除米糠多糖中的蛋白質。試驗結果表明:采用乙酸鋅-亞鐵氰化鉀法除蛋白的效果要好于Sevag法和三氯乙酸法,蛋白脫除率為87.9%,多糖損失率為17.5%。采用超濾技術分離純化得到不同組分米糠多糖,并分別命名為RBS-Ⅰ、RBS-Ⅱ、RBS-Ⅲ,3個組分得率分別為:43.1、38.5、18.7。對3種多糖組分進行抗氧化活性篩選,RBS-Ⅱ最為顯著,超氧自由基清除率為25.7%,羥基自由基清除率為47.6%,總抗氧化能力為81.4 U/mL。

米糠多糖; 脫蛋白; 超濾技術; 抗氧化性

0 引 言

我國是以大米為主食的國家,年產稻谷約2億噸,如以6%的出糠率計算,則我國年產米糠將達到1 200萬噸左右,居世界之首。但是米糠是一種產量大、綜合利用價值還不高的農副產品[1],所以對米糠進行深加工,提高其附加值具有重要意義。

米糠中存在著多種類型的多糖,其組分和結構也各不相同,具有廣泛的生物活性[2],在抗腫瘤、增強免疫力以及降脂效應等方面有顯著的功效,可用作制藥原料或保健營養(yǎng)品的開發(fā)[3-5]。用水提取多糖,常含有一定量的蛋白質[6],因此脫除米糠多糖中的蛋白質是多糖分離純化的重要步驟,可以有效提高多糖的生物活性。米糠中存在多種分子量的多糖,其組分和活性也各不相同,依據(jù)分子量的不同對其進行分離,可以獲得高活性的米糠多糖。

本研究在前期團隊的實驗基礎上,以擠壓超聲聯(lián)用提取的米糠多糖粗液為原料[7],分別采用Sevag法、三氯乙酸法、亞鐵氰化鉀-乙酸鋅法3種方法進行米糠多糖脫蛋白研究,并對比研究這幾種方法的脫除蛋白效果和多糖損失情況,從而篩選出米糠多糖的最佳脫蛋白方法,然后利用超濾分離方法實現(xiàn)不同分子量米糠多糖的分離,通過體外抗氧化活性實驗,從分級純化后的多糖組分中篩選出活性最強組分,并對其進行純度鑒定和理化性質研究。本研究從分子量大小角度篩選活性多糖是多糖分離純化的重要方法,為米糠多糖實現(xiàn)產業(yè)化提供理論支撐和基礎數(shù)據(jù),并為后續(xù)米糠多糖結構研究提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

米糠多糖粗液:采用本課題組已經研究的“擠壓超聲聯(lián)用提取米糠多糖”最佳工藝參數(shù)制得的米糠多糖粗液[7],米糠多糖得率7.18%。

試劑與儀器:氯仿,北京化學試劑公司;正丁醇,武漢江北化學試劑廠;三氯乙酸,成都科龍化學試劑廠;ABTS自由基清除能力檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所;大孔樹脂AB-8,上海摩速科學器材有限公司;咔唑,上?；瘜W試劑總廠;葡萄糖醛酸,上海伯奧生物科技有限公司;亞鐵氰化鉀,上海瑞齊生物科技有限公司;乙酸鋅,武漢江北化學試劑廠;VFD-2000真空冷凍干燥機,上海比郎儀器有限公司;流變儀,英國馬爾文儀器公司;K-360凱氏定氮儀,江瑞士buchi;Labscale TTF System小型切向超濾系統(tǒng),美國Millipore公司;Biomax Polyethersulfone小型超濾膜包,美國Millipore公司; TU-1800紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 米糠多糖脫蛋白研究

以多糖損失率和蛋白脫除率(%)為衡量指標,并比較幾種脫蛋白方法對米糠多糖的作用效果:1)Sevag 法[8];2)三氯乙酸法[9];3)亞鐵氰化鉀-乙酸鋅法。

1.2.2 米糠多糖的超濾分離[10-11]

選用截留分子量為10萬、3萬和1萬的超濾膜對多糖提取液進行截留,分別獲得大于10萬、3～10萬、1～3萬的3份多糖樣品液,舍棄1萬以下的樣品液,再分別將3分樣液冷凍干燥,重復濃縮循環(huán)操作。

1.2.3 體外抗氧化活性實驗篩選活性多糖組分[12]

對超濾分離的3個樣品,進行體外抗氧化活性實驗,對比篩選出活性最強的一組樣品進一步分離純化,繼續(xù)后續(xù)試驗。

1) 米糠多糖對超氧陰離子自由基清除能力的測定。

2) 米糠多糖清除羥自由基活性能力測定。

3) 總抗氧化能力的測定。

1.2.4 米糠多糖純度鑒定

將米糠多糖配置一定濃度的多糖樣品溶液,再用微孔過濾膜過濾,去2 mL樣品溶液過Sephadex G-100柱,然后用水溶液洗脫,每管10 mL,用硫酸-苯酚法跟蹤檢測,在490 nm波長下測得的吸光值對洗脫管數(shù)作圖,得到洗脫曲線。

1.2.5 米糠多糖組成成分及理化性質分析

1) 中性糖含量測定,見文獻[13]。

2) 糖醛酸含量測定,以葡萄糖醛酸為標準樣品制作標準曲線,采用硫酸咔唑法測糖醛酸的含量。

3) 蛋白質含量測定,見文獻[14]。

4) 米糠多糖理化性質分析[15-18]。

2 米糠多糖分離純化研究

2.1 米糠多糖脫蛋白研究

2.1.1 Sevag法

圖1 Sevag 法脫蛋白效果

由圖1可見,蛋白脫除率隨操作次數(shù)的增加而增加,4次脫蛋白操作后脫除率即可達到50%左右,但多糖損失率也會相應增加,分析原因可能是由于試驗中每次去除蛋白質的變性膠狀物時,不可避免地攜帶了部分多糖。董英等人、王升平等人的研究也得出這樣的結論[19-20],另外還有一些與蛋白質相結合的糖蛋白與蛋白聚糖在處理過程中有可能會沉淀下來,這些都是有可能造成多糖損失的原因。同時,重復操作都會在試驗器壁上存在掛壁損失,所以操作步驟越多最終的損失就會越大,這也是一方面的原因。

2.1.2 三氯乙酸法

圖2 三氯乙酸法脫蛋白效果

如圖2所示,隨著多糖提取液中三氯乙酸濃度的增加,蛋白質脫除率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,而多糖損失率則逐漸增大。當三氯乙酸添加量達到糖液體積50%時,糖液中蛋白去除率達到62.8%,多糖損失率達到18.4%。這是因為多糖在酸性環(huán)境中,糖苷鍵容易被破壞斷裂,多糖發(fā)生降解呈小分子片段,因此,隨三氯乙酸濃度的增加,多糖提取液中多糖得率較少、損失較嚴重。綜合考慮蛋白脫除率和多糖損失率,確定選用等體積添加濃度為50%的三氯乙酸溶液。此結果和他人的研究結果相吻合[21-23],可以作為脫蛋白的一種常用方法。

2.1.3 亞鐵氰化鉀-乙酸鋅法

圖3 亞鐵氰化鉀-乙酸鋅法脫蛋白效果

如圖3所示,隨亞鐵氰化鉀-乙酸鋅添加量的增多,蛋白質去除率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,而多糖損失率則逐漸增大。蛋白去除試劑濃度為0.6%時,糖液中蛋白脫除率達到87.9%,多糖損失率達到17.5%。這是因為隨亞鐵氰化鉀-乙酸鋅添加量的不斷增加,蛋白質與試劑結合發(fā)生沉淀的速度會加快,從而會發(fā)生沉淀不完全現(xiàn)象,導致蛋白的脫除率反而下降。而多糖在濃度較大的有機溶劑里會發(fā)生結構降解,所以隨亞鐵氰化鉀-乙酸鋅添加量的不斷增加,多糖的損失率加大。綜合考慮蛋白脫除率和多糖損失率,選擇0.6%的亞鐵氰化鉀-乙酸鋅添加量,此時蛋白質的脫除效果較好,而多糖的損失率也很低。亞鐵氰化鉀-乙酸鋅是一種比較溫和的試劑,對多糖結構的破壞不太嚴重。

2.1.4 3種脫蛋白方法的比較

圖4 3種脫蛋白方法對比

由圖4可見,3種方法都能在一定程度上達到脫除蛋白的效果,但3種方法也都會導致多糖有一定程度上的損失。單從蛋白脫除率上看,亞鐵氰化鉀-乙酸鋅法的蛋白脫除效果較好,從多糖損失率上分析,Sevag法的多糖損失率較低。從試劑方面選擇,三氯乙酸在操作過程中存在一定的危險性,對皮膚腐蝕較嚴重,對眼睛也具有一定危害,同時試劑使用量較大,從而提取成本就會增加。而亞鐵氰化鉀和乙酸鋅試劑的危險性小,使用量也很小,提取成本較低。Sevag法操作較復雜,蛋白脫除率低于另外2個方法,同時會增加蛋白脫除實驗時間。從綜合角度考慮,選擇亞鐵氰化鉀-乙酸鋅法對米糠多糖提取液進行脫蛋白處理效果最好。

2.2 米糠多糖超濾分離

超濾分離,是指以壓力差作為動力,超濾膜會對組分物質進行過濾,組分中分子量大的物質就會被截留,而溶劑和小分子物質則很容易透過。

超濾得到分子量為1萬～3萬、3萬～10萬和10萬以上3種米糠多糖樣品,分別命名為RBS-Ⅰ、RBS-Ⅱ、RBS-Ⅲ。本實驗對比了擠壓聯(lián)合超聲提取和熱水浸提2種米糠多糖提取工藝所得米糠多糖的超濾分離結果(熱水浸提多糖簡稱為WRBS,擠壓超聲提取多糖簡稱為URBS)。

圖5 2種提取方法多糖所占比例

如圖5所示,WRBS中分子量大于10萬的占多糖總量的24.8%,分子量在3萬～10萬的多糖占36.4%,而URBS中分子量大于10萬的占多糖總量的18.7%,分子量在3萬～10萬的多糖占38.2%。URBS中分子量大于10萬的多糖要比WRBS有所減少,而分子量在10萬以下的有所增加。這可能因為擠壓、超聲處理對多糖結構的物理破碎作用[24],使得多糖降解成較小分子量的多糖。但對于有些分子量高其活性就高的多糖,則不宜采用超聲提取。所以多糖的提取是個很復雜的工藝,提取工藝決定最終的多糖樣品品質。

2.3 米糠多糖的體外抗氧化活性實驗

2.3.1 米糠多糖對超氧陰離子自由基清除能力的測定

圖6 米糠多糖對超氧自由基的清除能力

圖6給出了不同分子量的米糠多糖對超氧陰離子自由基清除能力的結果。3種分子量大小的米糠多糖都對超氧自由基具有一定的清除能力,因此本實驗是一種擇優(yōu)的過程。隨著多糖濃度的升高,對超氧陰離子自由基的清除能力也在明顯提高。在多糖濃度為10 mg/mL時不同分子量的米糠多糖的清除率都達到最大,其中RBS-Ⅰ對超氧自由基的清除率為12.4%,RBS-Ⅱ對超氧自由基的清除率為25.7%,RBS-Ⅲ對超氧自由基的清除率為19.3%,可見,RBS-Ⅱ的清除能力最強,RBS-Ⅲ次之。對超氧自由基的清除率隨多糖溶液濃度的增加而增加,這是因為多糖濃度越大,單位體積內清除自由基的有效因子就會越多,分子與分子之間的碰撞可能性就越大,最終的活性也越高,這有些類似于酶的作用原理。而多糖濃度太高,則會造成多糖的浪費,因此需要選擇合適的多糖濃度進行研究。

2.3.2 米糠多糖清除羥自由基活性能力測定

圖7 米糠多糖對羥自由基清除能力

如圖7所示,3種不同分子量大小的米糠多糖對羥基自由基均具有一定的清除能力,研究結果表明,隨著多糖濃度的增大,3種多糖的清除能力隨之增大,呈現(xiàn)一種線性關系,質量濃度在10 mg/mL時3個多糖樣品對羥基自由基的清除率都達到最高,RBS-Ⅱ與RBS-Ⅲ對羥自由基清除能力相當,分別為47.6%和48.3%,RBS-Ⅰ對羥自由基清除能力較低為21.7%。

2.3.3 米糠多糖總抗氧化能力的測定

如圖8所示,3種不同分子量大小的米糠多糖均具有一定的總抗氧化能力作用,研究結果表明,隨著多糖濃度的增加,3種多糖的總抗氧化能力也增大,呈現(xiàn)一種線性關系,總抗氧化能力有顯著差異[26]。質量濃度在10 mg/mL時3個多糖樣品的抗氧化能力都達到最高,RBS-Ⅱ與RBS-Ⅲ的抗氧化能力相當,分別為79.8 U/mL和81.4 U/mL,RBS-Ⅰ的總抗氧化能力較低為58.9 U/mL。

2.3.4 3種米糠多糖樣品篩選

RBS-Ⅰ、RBS-Ⅱ、RBS-Ⅲ 3種多糖樣品在質量濃度為10 mg/mL時的體外抗氧化值進行對比分析,結果見圖9。

圖8 總抗氧化能力試驗結果

圖9 3種多糖樣品的抗氧化活性對比

如圖9所示,3種多糖溶液中,RBS-Ⅱ清除超氧陰離子的能力較強,可達25.7%,強于其他2種分子量多糖的清除能力;RBS-Ⅱ與RBS-Ⅲ清除羥自由基的能力相當,但均強于RBS-Ⅰ的清除能力;總抗氧化活性試驗表明,分子量較大的多糖溶液比分子量小的活性高;米糠多糖清除羥自由基的能力要比清除超氧陰離子的能力強;本實驗側重于對米糠多糖的一種抗氧化活性進行研究,這將為米糠多糖作為生理活性物質在保健食品領域的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

從超濾分離結果和體外抗氧化試驗結果顯示,3種不同分子量的米糠多糖所占的比例不同,其體外抗氧化活性也有較大的差異。因此,僅從所占比例或抗氧化活性角度考察對米糠多糖活性的成分開發(fā),可能會存在一定的缺陷。故本研究采用“所占比例×抗氧化活性”作為米糠多糖組份篩選的依據(jù),該成績越大,開發(fā)利用價值越大。所得結果如表1所示。

表1 不同分子量米糠多糖的開發(fā)利用價值

圖10 RBS-Ⅱ在Sephadex G-100層析柱上的色譜圖

由表1可得:RBS-Ⅱ的最終成績結果明顯高于其他2種米糠多糖,所以選擇RBS-Ⅱ多糖樣品進行后續(xù)試驗。

2.4 純度鑒定

如圖10所示,米糠多糖RBS-Ⅱ經Sephadex G-100凝膠柱層析,洗脫曲線并非為單一對稱峰,證明米糠多糖RBS-Ⅱ不是是單一組份。但是也有一個相對主峰,純度相對較高。

2.5 米糠多糖RBS-Ⅱ組成成分及理化性質分析

表2 米糠多糖RBS-Ⅱ的組成成分 %

多糖RBS-Ⅱ為黃宗色粉末狀固體,易溶于水,不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機溶劑。RBS-Ⅱ多糖的基本理化性質如表2所示:碘反應為陰性,說明多糖中沒有有力的淀粉顆粒。但是不排除有淀粉包裹粒。硫酸-咔唑反應程陽性,說明含有一定量的糖醛酸殘基,為后續(xù)試驗提供了一個證明。菲林試劑和三氯化鐵反應為陽性說明不含有還原糖,因為在試驗過程中有很多的降解反應,會產生大量的還原糖,所以這項指標的檢測很重要,也是一個純度的驗證。三氯化鐵反應為陽性說明不含有多芬類物質壞?？捡R斯亮藍反應為陰性,說明不含有游離的蛋白質成分,但是不能排除有沒有糖蛋白結合物。在后續(xù)試驗中會驗證這一疑慮。

表3 米糠多糖RBS-Ⅱ的理化性質

將米糠多糖RBS-Ⅰ、RBS-Ⅱ、RBS-Ⅲ配成20%的多糖溶液,用流變儀測定3個多糖樣品的表觀粘度;并參照文獻方法,測定其溶解度。測定結果見表4。

表4 3種多糖組份的粘度和溶解度

多糖的粘度主要是由多糖分子間的氫鍵相互作用和多糖分子量大小共同決定的,它與溶解度在一定程度上程負相關。多糖粘度也是臨床藥效發(fā)揮的關鍵因素,如果粘度過高,不利于藥物的擴散與吸收。有些藥物多糖因粘度過高,無法進行臨床使用,后經部分降解,粘性減小,但仍保持原有活性,已供臨床使用。

一般認為,多糖溶于水是發(fā)揮其功能活性的基本條件。大量試驗證明:通過適當?shù)娜軇┨幚?可使不溶于水的茯苓多糖變成易溶于水的活性多糖,同時其抗腫瘤活性也增強。

多糖的粘度和溶解度共同說明了多糖分子量過大或過小,其功能活性都較低,本實驗從分子量大小來篩選活性多糖是多糖分離純化的重要方法,為米糠多糖實現(xiàn)產業(yè)化提供理論支撐和基礎數(shù)據(jù)。

3 結 論

對比Sevag法、三氯乙酸法和乙酸鋅-亞鐵氰化鉀3種脫蛋白的方法,研究得出:乙酸鋅-亞鐵氰化鉀法蛋白脫除率高達87.9%。綜合考慮選擇乙酸鋅-亞鐵氰化鉀法進行脫蛋白。通過對米糠多糖的純化分離和體外抗氧化試驗篩選得出:RBS-Ⅱ的活性比其他2個較高一些,開發(fā)利用價值較大,可作為后續(xù)結構探究對象。由于超濾截留只是對多糖的初步純化,所得多糖的純度不是太高,純度鑒定時含有2個較大波峰,通過紫外掃描含有蛋白質波峰,但考馬斯亮藍反應為陰性,所以判定存在糖蛋白。

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Research on separation and purification of rice bran polysaccharide extracted by extrusion in conjunction with ultrasound

XIAOZhigang1,2,LIJie3,WANGPeng1,2,LIZhe2

(1.College of Grain Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China;2.College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;3.COFCO carnivorous (Shandong) Co.Ltd., Weifang 261000, China)

In this paper, the crude rice bran polysaccharides as the material was studied that the removal of the rice bran polysaccharides protein in it by the mothed of Sevag, Trichloroacetic acid and Zinc acetate-Potassium ferrocyanide.The results indicated that the effect of removal protein by zinc acetate-the potassium ferrocyanide is better than the Sevag and trichloroacetic acid method, most of the protein is removed and protein removal rate is 87.9%, polysaccharides loss rate is 17.5% by zinc acetate-the potassium ferrocyanide.Ultrafiltration technology was used to separate and purify Polysaccharide into three components.The three components were respectively named RBS-Ⅰ, RBS-Ⅱ, RBS-Ⅲ, and their polysaccharides yield were 43.1, 38.5, 18.7.The anti-oxidation of the three fraction polysaccharide was Screened, the result indicated that RBS-Ⅱ and RBS-Ⅲ activity are higher, and RBS-Ⅱ is the most significant.scavenging rate of superoxide radical was 25.7%, hydroxyl radical scavenging rate is 47.6, and the total antioxidant capacity is 81.4 U/mL.

rice bran polysaccharides; removal of protein; ultrafiltration technology; antioxidant ability

2014-10-20。

“十二五”農村領域國家科技支撐計劃項目(2012BAD34B02); 黑龍江省教育廳科學技術研究重點項目(12511z006); 哈爾濱市優(yōu)秀學科帶頭人基金資助項目(2012RFXXN107)。

肖志剛(1972-),男,黑龍江慶安人,沈陽師范大學教授,博士,東北農業(yè)大學博士研究生導師。

1673-5862(2015)01-0047-07

TS210.9

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2015.01.011