張 俊，徐亞男，鄧 會，程衛(wèi)東，肖 婧，史學(xué)偉*

（新疆石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

堿性蛋白酶指在堿性條件下能夠水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶，是酶學(xué)研究中較早也是最深入的一種酶[1]，堿性蛋白酶的用途非常廣泛，應(yīng)用于洗滌劑、食品、醫(yī)療、釀造、絲綢、制革等行業(yè)；同時，堿性蛋白酶也是用途最廣泛的酶制劑之一，除用于加酶洗滌劑外，還用于皮革脫毛、軟化、和獸皮、獸角等下腳料綜合利用（如明膠制備、醬油釀造、蛋白胨生產(chǎn)等）等方面[2-6]。堿性蛋白酶的廣泛使用，不僅縮短了培養(yǎng)時間，優(yōu)化了生產(chǎn)工藝，還節(jié)約了生產(chǎn)成本、提高了產(chǎn)品得率與質(zhì)量；同時堿性蛋白酶在廢物工業(yè)中廣泛使用，對減少環(huán)境的污染也做出了積極貢獻(xiàn)。

目前國際市場上雖然堿性蛋白酶品種多，但是所用工業(yè)生產(chǎn)菌株大多是應(yīng)用于食品加工。對于我國酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用開發(fā)而言，許多是低水平的重復(fù)，缺乏開拓創(chuàng)新，主要產(chǎn)酶菌株依靠進(jìn)口，以致我國一些酶制劑不論是質(zhì)量還是生產(chǎn)技術(shù)都與國外先進(jìn)水平有較大差距[7-11]。

解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）的不同菌株能合成大量的胞內(nèi)蛋白質(zhì)、油脂，分泌大量檸檬酸，并且能夠分泌各種蛋白質(zhì)，包括蛋白酶（酸性蛋白酶和堿性蛋白酶）、磷酸酶、脂肪酶等。因此該菌經(jīng)常被進(jìn)行代謝途徑改造后用來生產(chǎn)油脂、糖、淀粉酶和脂肪酸等[12-15]。本研究以具有產(chǎn)堿性蛋白酶能力的解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）ZJ059為出發(fā)菌株，通過紫外線（UV）-氯化鋰（LiCl）復(fù)合誘變處理得到一株高產(chǎn)堿性蛋白酶突變菌株F053，以堿性蛋白酶產(chǎn)量為評價指標(biāo)，采用正交優(yōu)化試驗對菌株F053培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化。以期為解脂耶羅維亞酵母在蛋白酶發(fā)酵工業(yè)上的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）ZJ059：本實驗室保藏菌種。

1.1.2 試劑

酵母浸粉、干酪素、牛肉膏、瓊脂粉、氯化鈉、硫酸鈣、硫酸鋅、硫酸鎂、蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨（分析純）：新疆沃德生物公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPED）培養(yǎng)基：酵母浸粉1.0%、蛋白胨2.0%、葡萄糖2.0%、蒸餾水100 mL、121 ℃蒸汽滅菌20 min。

蛋白酶篩選培養(yǎng)基：酪素0.5%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、氯化鈉1%、蒸餾水100 mL、121 ℃蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.0%、硫酸鈣0.075%，蒸餾水100 mL，121 ℃蒸汽滅菌20 min。

復(fù)篩選培養(yǎng)基：酪素2.0%、瓊脂粉2.0%、蒸餾水100 mL、121 ℃蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ES120型精密天平：上海力衡儀器儀表有限公司；SW-CJ-2D型超凈臺：上海尚道儀器設(shè)備有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海申賢恒溫設(shè)備廠；BHWY-211型變頻恒溫?fù)u床：常州諾基儀器有限公司；TGL-16型臺式高速離心機(jī)：金壇市城西麗華實驗儀器廠；W-201B型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市國旺實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種篩選方法

菌種→活化→UV-LiCl復(fù)合誘變處理→突變菌株篩選→堿性蛋白酶產(chǎn)量試驗→遺傳穩(wěn)定性試驗→發(fā)酵條件優(yōu)化試驗

1.3.2 菌株活化

將出發(fā)菌株接種于YPED液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取108CFU/mL菌懸液1 mL進(jìn)行10倍系列稀釋至10-1～10-6，選擇適宜的梯度涂布于篩選培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，挑取透明圈最大的單菌落接種于液體培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 UV-LiCl復(fù)合誘變試驗

選取處于對數(shù)生長期菌液，菌液用無菌生理鹽水稀釋到106個/mL，然后各取5 mL菌懸液于帶磁力轉(zhuǎn)子的培養(yǎng)皿中，各加入300 μL 10% LiCl混勻后開蓋進(jìn)行紫外線照射。分別在15 W紫外燈下30 cm處光照0、5 min、10 min、15 min、20 min。將經(jīng)過不同時間照射后的菌液黑暗處理稀釋10-3倍，100 μL菌液涂布于篩選培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)1～2 d。以未經(jīng)誘變的菌懸液作為對照，計算致死率。

1.3.4 高產(chǎn)堿性蛋白酶突變菌株的篩選

初篩：將誘變得到的菌株分別在兩個酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基上劃線，28 ℃培養(yǎng)24～48 h。在其中一個平板上加上適量的0.1 mol/L TCA 溶液，選擇水解圈直徑較大的菌落，挑取另一平板菌落經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后于4 ℃冰箱中重新保藏，作為進(jìn)一步復(fù)篩的出發(fā)菌株。

復(fù)篩：將出發(fā)菌株與初步篩選的突變菌株，分別按接種量3.0%接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，每組做3個平行，于28 ℃、180 r/min搖床發(fā)酵40～48 h，測定發(fā)酵液中的堿性蛋白酶酶活。

1.3.5 堿性蛋白酶活力測定

用Folin法測定[9]：在溫度55 ℃、pH 10.0 條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需酶量定義為1個酶活力單位，以U表示。

式中：K為常數(shù)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出，數(shù)值上等于OD680nm為1時所相當(dāng)酪氨酸微克數(shù)；E為平行試驗管的平均光密度值；N為稀釋倍數(shù)；4為離心管中反應(yīng)總體積，mL；10為反應(yīng)10 min；W為發(fā)酵液稱取質(zhì)量，g。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性實驗

選取誘變后透明圈大的菌株接入新的YEPD培養(yǎng)基上，在28 ℃培養(yǎng)24 h，作為第1代的出發(fā)菌株。每24 h后挑取菌落再次在新YEPD培養(yǎng)基斜面上劃線培養(yǎng)。每劃線1次定義為1代，共轉(zhuǎn)接5代。將各代菌株分別接種于30 mL種子培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h。將種子培養(yǎng)液各吸取3%的接種量接入3瓶30 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)40～48 h，即制成粗酶液。按照1.3.5測堿性蛋白酶活的方法分別測定堿性蛋白酶活力，每代測定3份平行樣。取平均值比較各代間的酶活性變化對菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行驗證。

1.3.7 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化正交試驗

分別以碳源、氮源、金屬離子為影響因素，探討其對獲得菌株的蛋白酶產(chǎn)量的影響，以產(chǎn)堿性蛋白酶量為指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交優(yōu)化試驗確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV-LiCl復(fù)合誘變劑量的確定

圖1 UV-LiCl 復(fù)合誘變致死率曲線Fig.1 Lethality curve of strain by UV-LiCl compound mutagenesis

LiCl是一種堿金屬鹵化劑，本身并無誘變作用，但與紫外線復(fù)合，克服了單純用紫外線誘變效果不理想的弊端，且在一定濃度范圍內(nèi)，有利于菌體正突變的發(fā)生[10]。按照1.3.3方法得到的致死率曲線如圖1所示。

從圖1可看出，隨著照射時間的延長，菌株致死率增大，當(dāng)照射時間為20 min時，出發(fā)菌株幾乎全部致死，根據(jù)誘變育種的產(chǎn)量突變中大多傾向于采用較低劑量的原則，選擇致死率為80%～90%的誘變劑量進(jìn)行誘變[11]，而當(dāng)照射時間為13 min時，致死率在80%左右。本實驗選取紫外誘變照射的時間為13 min。

2.2 突變菌株的初篩

ZJ059菌株經(jīng)紫外照射13 min 后，平板初篩37個單菌落，選取透明圈直徑較大的13個菌落數(shù)進(jìn)行蛋白酶產(chǎn)量試驗搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測定蛋白酶產(chǎn)量試驗。結(jié)果見表1。

表1 突變菌株產(chǎn)蛋白酶復(fù)篩結(jié)果Table 1 Screening results of mutant strains with high alkaline protease yield

由表1可以看出，產(chǎn)酶量最高的前5株突變菌株分別為：F053、F049、F038、F043、F039，其堿性蛋白酶酶活分別為43.62 U/L、41.76 U/L、41.56 U/L、39.53 U/L、38.57 U/L，都比出發(fā)菌株ZJ059的蛋白酶酶活（23.61 U/L）高，因此選擇這5株突變菌進(jìn)行遺傳穩(wěn)定試驗。

2.3 突變菌株產(chǎn)酶量遺傳穩(wěn)定性試驗

圖2 突變菌株連續(xù)五代產(chǎn)酶量遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果Fig.2 Results of enzyme production hereditary stability of mutant strains with five consecutive generation

為檢驗所得突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，將獲得的5株突變菌株按照1.3.6方法進(jìn)行連續(xù)5代傳代培養(yǎng)，觀察每次傳代后菌株的菌落特征、個體形態(tài)特征、產(chǎn)酶量的變化，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，所得的5株菌的產(chǎn)堿性蛋白酶酶量都比較穩(wěn)定，產(chǎn)酶量變幅范圍在1%以內(nèi)，表示遺傳穩(wěn)定性較好。其中菌株F053的產(chǎn)酶量在5代中都為最高，其前3代的產(chǎn)酶量呈微上升趨勢，在第3代達(dá)到最高（40.62 U/L），之后略有下降。對菌株F053進(jìn)行了菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)觀察，其菌落形態(tài)呈圓形，白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，中間凸起。菌株F053經(jīng)過5代傳代培養(yǎng)，其菌落形態(tài)一致，且透明圈明顯；菌株的個體形態(tài)正常。綜合以上結(jié)果，確定菌株F053為最終篩選的高產(chǎn)堿性蛋白酶突變菌株。

2.4 解脂假絲酵母菌產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

2.4.1 碳源對突變菌株發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響

本試驗使用的碳源有蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉，為了探討其對突變菌產(chǎn)酶的影響，使用不同含量的碳源配合發(fā)酵培養(yǎng)基（干酪素0.5%，牛肉膏0.3%），結(jié)果見圖3。

圖3 碳源類型及用量對菌株F053發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響Fig.3 Effect of carbon sources and addition on alkaline protease yield by strain F053

從圖3可以看出，葡萄糖對解脂假絲酵母菌產(chǎn)堿性蛋白酶量貢獻(xiàn)大，蔗糖對產(chǎn)酶量貢獻(xiàn)較小。用量為1%～5%時，葡萄糖對產(chǎn)酶量的貢獻(xiàn)都高于其他碳源，可見葡萄糖為最適合的碳源，其中在用量為2%時，解脂假絲酵母菌產(chǎn)堿性蛋白酶量最高。因此，應(yīng)選擇葡萄糖作為碳源進(jìn)行下一步試驗，其添加量為2%。

2.4.2 氮源對突變菌株發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響

本試驗使用的氮源有蛋白胨、酵母粉、尿素、硫酸銨，確定葡萄糖添加量為2%，探討氮源對菌株產(chǎn)堿性蛋白酶量的影響，結(jié)果見圖4。

從圖4可看出，蛋白胨對菌株產(chǎn)酶量影響更大，因此應(yīng)選擇蛋白胨用于發(fā)酵產(chǎn)酶。其用量在1%～5%范圍內(nèi)時，堿性蛋白酶產(chǎn)量呈微下降趨勢，蛋白胨用量在1%時堿性蛋白酶產(chǎn)量最大，因此選用蛋白胨作為突變菌株的氮源，蛋白胨的用量為1%。

圖4 氮源類型及用量對菌株F053發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen sources and addition on alkaline protease yield by strain F053

2.4.3 金屬離子對突變菌株發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響

本試驗使用的金屬離子有氯化鈉、硫酸鈣、氯化鋅、硫酸鎂。在確定碳源、氮源及其用量的前提下，探討金屬離子對菌株產(chǎn)酶量的影響結(jié)果見圖5。

圖5 金屬離子類型及用量對菌株F053發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的影響Fig.5 Effect of metal ion and addition on alkaline protease yield by strain F053

從圖5可看出，鈣離子對菌株產(chǎn)蛋白酶的影響較大，鋅離子對菌株產(chǎn)蛋白酶的影響較小，使用量為0.05%～0.25%時鈣離子對菌株產(chǎn)蛋白酶的影響大于其他金屬離子，其中在用量為0.05%時，菌株產(chǎn)酶量最高。因此，應(yīng)選擇在培養(yǎng)基中添加鈣離子來提高菌株產(chǎn)酶量，其添加量為0.05%。

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，為了更好地研究碳源、氮源及金屬離子的搭配組合對突變菌株產(chǎn)酶量的影響情況，設(shè)計了3因素3水平的正交試驗，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

從表2可知，各因素菌株產(chǎn)酶量影響的大小依次為葡萄糖添加量＞蛋白胨添加量＞硫酸鈣添加量，其中葡萄糖用量是最主要的影響因素；從各因子的k值可看出，碳源、氮源及金屬離子用量的最佳搭配組合為A2B1C3，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，硫酸鈣0.075%。經(jīng)過驗證試驗，出發(fā)菌株ZJ059在此培養(yǎng)基組合下菌株產(chǎn)酶為36.85 U/L，而UV-LiCl復(fù)合誘變的突變菌株F053的堿性蛋白酶產(chǎn)量為44.39 U/L，產(chǎn)量提高20.46%。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium composition optimization

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

從表4方差分析結(jié)果可以看出，葡萄糖溶液質(zhì)量濃度對產(chǎn)堿性蛋白酶含量有顯著性影響（P＜0.01）。

3 結(jié)論

以菌株ZJ059為出發(fā)菌株，通過UV-LiCl 復(fù)合誘變的方法獲得了13株高產(chǎn)堿性蛋白酶的突變菌株。高產(chǎn)堿性蛋白酶突變菌株通過遺傳穩(wěn)定試驗選取一株高產(chǎn)堿性蛋白酶并且遺傳穩(wěn)定性較好的的突變菌株，將其命名為F053。

將突變菌株F053通過單因素試驗確定了碳源、氮源、金屬離子的種類及用量的，通過正交試驗確定了菌株F053發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的最佳培養(yǎng)基成分為葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，硫酸鈣0.075%。在此培養(yǎng)基條件下，堿性蛋白酶產(chǎn)量為44.39 U/L，產(chǎn)量提高20.46%。

目前我國工業(yè)上生產(chǎn)的堿性蛋白酶的菌株主要是以進(jìn)口為主，缺少創(chuàng)新特點。后期研究工作的重點是高產(chǎn)堿性蛋白酶進(jìn)行分離純化，并對純酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。蛋白酶的應(yīng)用開拓新的渠道，特別是在醫(yī)學(xué)（生物制藥及化療等）及生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用，提高產(chǎn)品競爭力。

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