李福才，曹尚志，鄧 穎，汪浩勇*

（湖北工業(yè)大學(xué) 輕工學(xué)部，發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068）

全球每年消耗巨大的化石能源，主要是煤、石油、天然氣等。據(jù)國(guó)際能源資料統(tǒng)計(jì)和專家預(yù)言，適合經(jīng)濟(jì)開(kāi)采的石油和天然氣資源只能再開(kāi)采30年，最多50年[1]。因此，許多國(guó)家已經(jīng)將燃料乙醇的研究和應(yīng)用擺到了重要的戰(zhàn)略地位[2-3]。與傳統(tǒng)酵母相比，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）具有發(fā)酵速率快、糖利用率高，耐酒精能力強(qiáng)、對(duì)纖維素原料水解液中的抑制物的抵抗能力強(qiáng)、菌體生成少，代謝產(chǎn)物少，不必定期供氧，乙醇生產(chǎn)量高和能耐高滲透壓等優(yōu)點(diǎn)[4-6]。TORRES E F等[7]用原型菌CP4在葡萄糖質(zhì)量濃度為223 g/L，發(fā)酵70 h時(shí)，得到乙醇產(chǎn)量為105 g/L。傅云霞等[8]用250 g/L的總糖發(fā)酵，最終酒精含量達(dá)7.7%vol。車勇平[9]在葡萄糖質(zhì)量濃度為223 g/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到乙醇產(chǎn)量為95.47 g/L。

本實(shí)驗(yàn)采用合成生物學(xué)的方法和Tn5轉(zhuǎn)座技術(shù)，構(gòu)建了細(xì)菌染色體同時(shí)整合了7個(gè)基因[10]（Pfu-sHSP，yfdZ，metB，xylA，xylB，tktA以及talB）的重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌HYMX。

響應(yīng)面分析法[11-12]（response surface method，RSM）可以進(jìn)行試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)，其在實(shí)驗(yàn)室和工廠研發(fā)中使用非常很廣[13]。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)包括Placket-Barman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，最陡爬坡試驗(yàn)和中心組合試驗(yàn)（central componse design，CCD）。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行PB試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和中心組合試驗(yàn)。采用Design Expert 8.0設(shè)計(jì)軟件對(duì)各因素最優(yōu)水平及交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌HYMX發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乙醇的工藝，獲得了乙醇產(chǎn)量最高時(shí)的發(fā)酵工藝參數(shù)，對(duì)高濃度糖發(fā)酵獲取燃料乙醇具有一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）CP4（原型菌）：由本實(shí)驗(yàn)室保藏；Zymomonas mobilisHYMX：由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）種子培養(yǎng)基：100 g/L葡萄糖，0.5 g/L尿素，10 g/L酵母提取物，1 g/L磷酸二氫鉀，0.5 g/L七水硫酸鎂，調(diào)節(jié)pH 6.0，115 ℃滅菌30 min。

（2）普通發(fā)酵培養(yǎng)基：275 g/L葡萄糖，0.5 g/L尿素，10 g/L酵母提取物，1 g/L磷酸二氫鉀，0.5 g/L七水硫酸鎂，調(diào)節(jié)pH 6.0，115 ℃滅菌30 min。

（3）其他糖濃度發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5 g/L尿素，1 g/L磷酸二氫鉀，0.5 g/L七水硫酸鎂。酵母提取物，葡萄糖，pH根據(jù)需要作相應(yīng)調(diào)整。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、尿素、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC7890F型氣相色譜儀：上海天美科學(xué)儀器有限公司；CT-1型氮?dú)淇諝獍l(fā)生器：武漢科林普豐儀器有限公司；UV-2000型可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；11-J7721型高壓滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子活化

用種子培養(yǎng)基，按10%的接種量接種，于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置活化28～30 h，使其OD600nm在8～10時(shí)即可作為種子接種發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3.2 發(fā)酵

將種子液按10%的接種量接種普通發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量共計(jì)14 mL，在15 mL的帶塞試管中發(fā)酵。置于32 ℃恒溫箱中，厭氧、靜置發(fā)酵60 h。

1.3.3 乙醇含量的檢測(cè)

采用氣相色譜法測(cè)定乙醇的產(chǎn)量[14]。氣相色譜條件：TM-930色譜柱（25 m×0.53 mm×1.0 μm），火焰離子檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），進(jìn)樣量0.8 μL，分流比為50∶1，柱溫80 ℃，進(jìn)樣溫度200 ℃，檢測(cè)溫度250 ℃，氮?dú)庾鳛檩d氣。計(jì)算方法為內(nèi)標(biāo)法，用正丁醇作為內(nèi)標(biāo)。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

進(jìn)行單因素試驗(yàn)的變量有葡萄糖質(zhì)量濃度（245 g/L、260 g/L、275 g/L、290 g/L、305 g/L），初始pH值（4、5、6、7、8），發(fā)酵時(shí)間（40 h、50 h、60 h、70 h、80 h），培養(yǎng)溫度（26 ℃、29 ℃、32 ℃、35 ℃、38 ℃），接種量（6%、8%、10%、12%、15%），酵母提取物質(zhì)量濃度（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）。分別研究各單因素對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響。

1.3.5 Plackett-Burman試驗(yàn)[15]

選取6個(gè)因素，分別為葡萄糖質(zhì)量濃度（g/L）、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間（h）、發(fā)酵溫度（℃）、接種量（%），酵母提取物質(zhì)量濃度（g/L），每個(gè)因素分別選取高（1）、低（-1）兩個(gè)水平，應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件，進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析，以乙醇產(chǎn)量為響應(yīng)值。共進(jìn)行12組試驗(yàn)。

1.3.6 爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)爬坡試驗(yàn)，找到逼近最大響應(yīng)值的區(qū)域，只有逼近最大響應(yīng)值區(qū)域，才能建立有效的擬合方程，擬合方程才能反映真實(shí)的情形。

1.3.7 中心組合試驗(yàn)[16]

根據(jù)PB試驗(yàn)及爬坡試驗(yàn)的分析結(jié)果，設(shè)計(jì)葡萄糖質(zhì)量濃度、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間3因素4水平試驗(yàn)的CCD試驗(yàn)。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到乙醇產(chǎn)量最高的最佳工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

圖1 葡萄糖質(zhì)量濃度(A)、初始pH值(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)、發(fā)酵溫度(D)、接種量(E)，酵母提取物質(zhì)量濃度(F)對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of glucose concentration (A),initial pH (B),fermentation time (C),temperature (D),inoculum (E),yeast extract concentration (F) on ethanol production

不同葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)乙醇產(chǎn)量影響結(jié)果如同1A所示，在290 g/L時(shí)乙醇產(chǎn)量最高，為132.5 g/L。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度繼續(xù)升高時(shí)，高糖對(duì)重組菌產(chǎn)乙醇開(kāi)始有抑制作用，使產(chǎn)量開(kāi)始降低。

不同初始pH值對(duì)乙醇產(chǎn)量影響結(jié)果如圖1B所示，在pH值為6時(shí)，乙醇產(chǎn)量最高為129.8 g/L。

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇產(chǎn)量影響結(jié)果如圖1C所示，在60 h時(shí)，乙醇產(chǎn)量最高為130.9 g/L。

不同發(fā)酵溫度對(duì)乙醇產(chǎn)量影響結(jié)果如圖1D所示，由于重組菌株導(dǎo)入了對(duì)熱有抗性的高嗜熱古細(xì)菌的熱休克蛋白基因Pfu-sHSP，對(duì)高溫耐受性提高，在35 ℃、38 ℃時(shí)，產(chǎn)量略有降低，但最高點(diǎn)仍在32 ℃，在32 ℃時(shí)，乙醇產(chǎn)量最高為130.03 g/L。

不同接種量對(duì)乙醇產(chǎn)量影響結(jié)果如圖1E所示，當(dāng)接種量為10%、12%時(shí)，乙醇產(chǎn)量最高，均為129 g/L，為了節(jié)約成本，選取10%的接種量為最佳接種量。

不同質(zhì)量濃度的酵母提取物對(duì)乙醇產(chǎn)量影響結(jié)果如圖1F所示，當(dāng)酵母提取物質(zhì)量濃度為10 g/L、15 g/L時(shí)，乙醇產(chǎn)量基本一致，為了節(jié)約成本，選取酵母提取物質(zhì)量濃度為10 g/L，此時(shí)乙醇產(chǎn)量最高為128.14 g/L。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析

PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見(jiàn)表1，顯著性水平見(jiàn)表2。根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)，模型P值為0.030 5＜0.05，表明該模型達(dá)到顯著水平。A因素、B因素、C因素的P值分別為0.008 4、0.022 6、0.017 2，均＜0.05，表明因素A、B、C均達(dá)到顯著水平。因此，葡萄糖質(zhì)量濃度，初始pH值及發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇產(chǎn)量（Y）影響顯著，在進(jìn)行CCD試驗(yàn)時(shí)，主要考慮這三個(gè)因素。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Design and results of Plackett-Burman experiments

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

2.3 爬坡試驗(yàn)結(jié)果及分析

當(dāng)逼近響應(yīng)值最大區(qū)域時(shí)，越能夠反映真實(shí)情形，根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，葡萄糖質(zhì)量濃度，pH值及發(fā)酵時(shí)間均為正效應(yīng)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，葡萄糖質(zhì)量濃度285 g/L，pH值為7.0，發(fā)酵時(shí)間70 h時(shí)，乙醇含量達(dá)到最高134.18 g/L，即第三組試驗(yàn)最接近最佳值區(qū)域，因此可以選擇第三組試驗(yàn)附近值為中心點(diǎn)，進(jìn)行CCD試驗(yàn)。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of the steepest ascent experiment

2.4 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計(jì)CCD試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4；試驗(yàn)結(jié)果方差分析[17-18]見(jiàn)表5。

從表5可知，模型P值=0.001 7＜0.05，達(dá)到顯著水平；失擬P值=0.062 12＞0.05，不顯著；一次項(xiàng)A、B的P值分別為0.003 6、0.020 5，均＜0.05，影響顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2的P值均＜0.05，影響顯著。而AB、AC、BC的P值均＞0.05，交互作用不顯著。

用Design-Expert 8.0得出回歸方程為Y=134.71+5.41A+3.93B-0.38C+2.41AB+0.82AC-0.012BC-7.06A2-5.9B2-4.77C2。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.876，說(shuō)明乙醇產(chǎn)量的87.6%源于所選變量，模型模擬較好。最佳發(fā)酵工藝條件為葡萄糖質(zhì)量濃度285 g/L，初始pH值為6.5，發(fā)酵時(shí)間63 h，在此最佳工藝條件下，乙醇產(chǎn)量為137.89 g/L。

表4 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of CCD experiment

表5 CCD試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of CCD experiments results

2.5 響應(yīng)面圖及等高線

各因素的交互作用可以從響應(yīng)曲面的坡度變化及等高線的形狀得到反映，響應(yīng)面坡度變化較緩慢，說(shuō)明對(duì)響應(yīng)值的影響不大；如果坡度變化較陡峭，說(shuō)明對(duì)響應(yīng)值影響較大。在等高線圖中，圖形越接近橢圓形表示交互作用越顯著，越接近圓形表示交互作用越小，甚至可以忽略。圖2為葡萄糖糖質(zhì)量濃度、pH值、發(fā)酵時(shí)間兩兩交互作用對(duì)乙醇產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖及等高圖，反映了各因素及交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。由圖2及表5可知，葡萄糖糖質(zhì)量濃度、pH值、發(fā)酵時(shí)間的兩兩交互作用均未達(dá)到顯著水平。

圖2 葡萄糖質(zhì)量濃度、發(fā)酵時(shí)間及pH值的交互作用對(duì)乙醇產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface plots of effect of interaction between glucose concentration,fermentation time and pH on ethanol production

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

在葡萄糖質(zhì)量濃度285 g/L，pH 6.5，發(fā)酵時(shí)間63 h，發(fā)酵溫度32 ℃，接種量10%，酵母提取物10 g/L的條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)6次，乙醇產(chǎn)量分別為：137.82 g/L、138.13 g/L、136.52 g/L、136.47 g/L、137.21 g/L、136.52 g/L，取平均值為137.11 g/L，與預(yù)測(cè)偏差0.57%。優(yōu)化后乙醇產(chǎn)量比優(yōu)化前的最高乙醇產(chǎn)量130.9 g/L提高了4.53%，比原型菌的乙醇產(chǎn)量72.17 g/L提高了89.98%。

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的一株重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilisHYMX發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乙醇的工藝及培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化，主要考察了糖質(zhì)量濃度、初始pH、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、酵母提取物添加量這6個(gè)單因素對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響。根據(jù)PB試驗(yàn)，葡萄糖質(zhì)量濃度，初始pH值，發(fā)酵時(shí)間影響顯著；根據(jù)CCD試驗(yàn)，最佳發(fā)酵條件為葡萄糖質(zhì)量濃度285 g/L，pH值為6.5，發(fā)酵時(shí)間63 h，發(fā)酵溫度32 ℃，接種量10%，酵母提取物質(zhì)量濃度10 g/L。此發(fā)酵工藝條件下最高乙醇產(chǎn)量為137.11 g/L，比優(yōu)化前的最高乙醇產(chǎn)量130.9 g/L提高了4.53%，比原型菌的乙醇產(chǎn)量72.17 g/L提高了89.98%。

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