李海燕

（1.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院 華北研究所，北京 101300；2.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室 上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，上海 200436）

開菲爾是一種原產(chǎn)自高加索地區(qū)的傳統(tǒng)的酒精性發(fā)酵乳飲料，傳統(tǒng)的開菲爾是由開菲爾粒發(fā)酵牛乳或羊乳而制成的一種含有氣體和酒精風(fēng)味的發(fā)酵乳制品。開菲爾粒外觀呈乳白色或淺黃色，表面凸凹不平，呈花椰菜或珊瑚狀的彈性塊狀物體，直徑為1～30 mm。開菲爾粒表面上共生著多種乳酸菌和酵母菌，長期飲用可以調(diào)節(jié)人體腸道菌群，使乳酸菌成為腸道的優(yōu)勢菌群，形成人體的天然屏障，從而抑制病原菌的入侵。

本試驗以干燥濃縮的開菲爾顆粒Kefir M為發(fā)酵劑，制備活菌型開菲爾酸乳飲料，并研究不同試驗因素對產(chǎn)品品質(zhì)的影響，確定最優(yōu)工藝與配方。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無抗鮮牛奶：光明自有牧場；羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose，CMC）、高甲氧基果膠：喬富企業(yè)有限公司；蔗糖：廣西農(nóng)墾糖業(yè)集團(tuán)股份有限公司；開菲爾發(fā)酵劑Kefir M：丹尼斯克（中國）菌種有限公司；菌種組成包含乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）、乳酸乳球菌乳酸亞種丁二酮變種（Lactococcus lactissubsp.Lactis biovar.diacetylactis）、腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermonphilus）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）。孟加拉紅培養(yǎng)基（蛋白胨0.05%、葡萄糖1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、瓊脂2%、孟加拉紅溶液0.1 L、氯霉素0.1%、蒸餾水1 L），MRS培養(yǎng)基（蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、磷酸氫二銨0.2%、葡萄糖3%、吐溫80 0.1%、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.05%、硫酸錳0.02%、瓊脂2%、蒸餾水1L）。

1.2 儀器與設(shè)備

CP124S電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；APV-1000均質(zhì)機(jī)：丹麥APV公司；EUROSTAR攪拌器：德國IKA公司；PHB-4型精密pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Water Baths恒溫水浴鍋：德國GFL公司；320A/C黏度計：美國BROOKFIELD公司；超凈工作臺：北京冠鵬凈化設(shè)備有限責(zé)任公司；GNP-9080型防水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸乳飲料工藝流程

鮮牛乳+蔗糖→預(yù)熱溶解→混合均勻→均質(zhì)→殺菌→冷卻→接種→發(fā)酵→后熟→破乳攪拌→加入糖和穩(wěn)定劑的混合溶液→攪勻→調(diào)酸→二次無菌均質(zhì)→冷卻→灌裝

1.3.2 操作要點

發(fā)酵劑發(fā)酵溫度的確定：開菲爾發(fā)酵劑的發(fā)酵溫度一般在23～30 ℃，采用不同的發(fā)酵溫度，確定適宜制作開菲爾酸乳飲料的最佳發(fā)酵溫度。

發(fā)酵劑添加量的確定：發(fā)酵劑以0.2 U/kg的添加量，按無菌操作添加，攪拌5 min混勻后發(fā)酵。

配料、均質(zhì)、殺菌：將生牛乳升溫至50～60 ℃，加入蔗糖，攪拌15 min混勻。均質(zhì)溫度為60～65 ℃，壓力為18～22 MPa，按照優(yōu)選出的發(fā)酵劑添加量與發(fā)酵溫度發(fā)酵，待發(fā)酵終點達(dá)到80～100°T時終止發(fā)酵，冰水冷卻后攪拌，4 ℃冷藏備用。

穩(wěn)定劑的溶解：將CMC和高甲氧基果膠按照一定比例混合，與蔗糖混合均勻，溶解于65 ℃的凈化水中，攪拌20 min混合均勻，經(jīng)95 ℃、保溫5 min殺菌，冷卻至40 ℃以下備用。

調(diào)酸：將發(fā)酵乳加入穩(wěn)定劑溶液中混合均勻，待混合液降至20 ℃以下時，保持高速攪拌，將檸檬酸溶解于10倍蒸餾水后，緩慢加到發(fā)酵乳和穩(wěn)定劑的混合液中，加酸結(jié)束后保持?jǐn)嚢?0 min，最終保持成品的pH值為4.10～4.20為宜。

二次均質(zhì)：經(jīng)試驗，確定二次均質(zhì)溫度為20～30 ℃，壓力為18～20 MPa時產(chǎn)品的穩(wěn)定性較好。

灌裝：均質(zhì)后的產(chǎn)品冷卻至2～6 ℃，灌裝、冷藏。

1.3.3 分析與檢測

保質(zhì)期內(nèi)酸度的測定：參考文獻(xiàn)[7]，采用吉爾涅爾度（°T）。

保質(zhì)期內(nèi)乳酸菌活菌數(shù)的測定：開菲爾酸乳飲料于4 ℃冷藏，測定乳酸菌活菌數(shù)。將飲料用滅菌生理鹽水梯度稀釋至一定數(shù)量級的濃度后，采用MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注平板培養(yǎng)，于42 ℃培養(yǎng)48 h后計菌落總數(shù)，測定乳酸菌活菌數(shù)。

保質(zhì)期內(nèi)霉菌及酵母總數(shù)的測定：按照GB 4789.15—2010《食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》規(guī)定的方法檢測。開菲爾酸乳飲料于4 ℃冷藏，將飲料用滅菌生理鹽水梯度稀釋至一定數(shù)量級的濃度后，采用孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基傾注平板培養(yǎng)，于（28±1）℃培養(yǎng)5 d后計霉菌和酵母菌落總數(shù)，并在觀察期內(nèi)記錄霉菌及酵母菌數(shù)。

感官評定：開菲爾酸乳飲料由20名專業(yè)人員進(jìn)行品嘗，作出綜合感官評價，并觀察產(chǎn)品的顏色、狀態(tài)、氣味，感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1（滿分100分）。

表1 開菲爾活菌型酸乳飲料感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of lactic acid bacteria beverage with kefir

2 結(jié)果與分析

2.1 開菲爾酸乳飲料配方、工藝單因素試驗

本試驗以產(chǎn)品口感和穩(wěn)定性為最終評判標(biāo)準(zhǔn)，選擇對影響開菲爾酸乳飲料品質(zhì)較為主要的4個因素：羧甲基纖維素鈉、果膠、蔗糖、發(fā)酵溫度作為研究對象，開菲爾發(fā)酵劑Kefir M添加量為0.2 U/kg的條件下進(jìn)行單因素試驗，優(yōu)化產(chǎn)品工藝、配方。

2.1.1 發(fā)酵溫度對酸乳飲料感官評分的影響

將發(fā)酵劑按照無菌操作，接種到滅菌、冷卻后的牛乳中，在蔗糖添加量7%，CMC添加量0.20%，果膠添加量0.15%的條件下，采用不同的發(fā)酵溫度，發(fā)酵12 h，研究不同發(fā)酵溫度下制作的發(fā)酵乳基料對酸乳飲料成品品質(zhì)的影響，結(jié)果見表2。

表2 發(fā)酵溫度對開菲爾酸乳飲料品質(zhì)的影響Table 2 Effect of fermentation temperature on the quality of the lactic acid bacteria beverage with kefir

由表2可知，發(fā)酵溫度較低時，發(fā)酵乳酸度較低，在調(diào)酸工藝中，需要添加較多的檸檬酸來調(diào)整酸乳飲料的終點酸度，導(dǎo)致酸乳飲料口感較為酸澀；發(fā)酵溫度較高時，發(fā)酵乳產(chǎn)酸太快，形成較多蛋白凝結(jié)顆粒與乳清，發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)較差，會降低酸乳飲料的穩(wěn)定性。較為適宜的發(fā)酵溫度為25～31 ℃。

2.1.2 蔗糖添加量對酸乳飲料感官評分的影響

在發(fā)酵溫度為28 ℃，CMC添加量0.20%，果膠添加量0.15%時，選擇不同的蔗糖添加量，探討蔗糖添加量對開菲爾酸乳飲料品質(zhì)的影響，結(jié)果見表3。

表3 蔗糖的添加量對開菲爾酸乳飲料品質(zhì)的影響Table 3 Effect of sugar on the quality of the lactic acid bacteria beverage with kefir

由表3可知，蔗糖添加量太少，酸奶口感偏酸，凝乳狀態(tài)較軟，且乳清析出較多。蔗糖量添加太多，口感偏甜。蔗糖添加量為6%～8%較適宜。

2.1.3 羧甲基纖維素鈉添加量的確定

在發(fā)酵溫度為28 ℃，蔗糖添加量為7%，高甲基果膠添加量為0.15%的條件下，選擇不同的羧甲基纖維素鈉的添加量，探討其對開菲爾酸乳飲料品質(zhì)的影響，結(jié)果見表4。

表4 羧甲基纖維素鈉添加量對開菲爾酸乳飲料品質(zhì)的影響Table 4 Effect of CMC on the quality of the lactic acid bacteria beverage with kefir

由表4可知，羧甲基纖維素鈉添加量太高，產(chǎn)品黏度較高，口感不清爽，添加量太低，會出現(xiàn)乳清析出。羧甲基纖維素鈉添加量為0.15%～0.25%時，產(chǎn)品狀態(tài)及口感較好。

2.1.4 高甲氧基果膠添加量的確定

表5 高甲氧基果膠添加量對開菲爾酸乳飲料品質(zhì)的影響Table 5 Effect of high methoxyl pectin on the quality of the lactic acid bacteria beverage with kefir

在發(fā)酵溫度為28 ℃，蔗糖添加量為7%，羧甲基纖維素鈉添加量為0.20%的條件下，選擇不同的高甲氧基果膠的添加量，探討其對開菲爾酸乳飲料品質(zhì)的影響，結(jié)果見表5。

由表5可知，高甲氧基果膠添加量為0.05%～0.10%時，產(chǎn)品穩(wěn)定性較差，較多蛋白沉淀與乳清析出；添加量增加，產(chǎn)品狀態(tài)較為穩(wěn)定，但口感和穩(wěn)定性差異不明顯。從產(chǎn)品成本和穩(wěn)定性綜合考慮，高甲氧基果膠添加量為0.1%～0.2%時，產(chǎn)品穩(wěn)定性及口感較好。

2.2 開菲爾酸乳飲料配方、工藝的優(yōu)選試驗

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，將CMC、果膠、蔗糖、發(fā)酵溫度的其添加量及組合采用L9（34）正交試驗，確定產(chǎn)品的最佳工藝及配方，正交試驗因素水平見表6，試驗結(jié)果見表7，方差分析見表8。

表6 開菲爾酸乳飲料工藝配方優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 6 Factors and levels of orthogonal experiment for beverage formula and process optimization

表7 開菲爾酸乳飲料工藝配方優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiment for beverage formula and process optimization

從表6可知，A、B、C、D四個因素對產(chǎn)品品質(zhì)的影響作用分別是B＞A＞C＞D，不同的穩(wěn)定劑種類、蔗糖添加量及發(fā)酵溫度的組合對產(chǎn)品的品質(zhì)有很大的影響。CMC對菲爾酸乳飲料的品質(zhì)影響最大，其次是發(fā)酵溫度、果膠和蔗糖的添加量，配方最優(yōu)組合為A2B2C3D3，即發(fā)酵溫度28 ℃，CMC 0.20%，果膠0.20%，蔗糖8%，在此試驗條件下進(jìn)行感官驗證，產(chǎn)品感官評分為92分。

表8 正交試驗方差分析Table 8 Variance analysis of the orthogonal experiment

為進(jìn)一步判斷發(fā)酵溫度、CMC、果膠、白砂糖4個因素對正交試驗結(jié)果的影響，將數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。從表8可以看出，試驗結(jié)果的方差分析與正交試驗的結(jié)果是一致的，CMC的添加量對凝固型綠豆酸奶的感官評價有顯著影響，其他因素影響不顯著。

2.3 產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

感官指標(biāo)：色澤呈乳白色，組織狀態(tài)均勻，有微量乳清析出，無肉眼可見雜質(zhì)。口味清爽、有少量氣泡，質(zhì)構(gòu)細(xì)膩，甜酸適宜，具有獨特的開菲爾發(fā)酵風(fēng)味，無異味。

理化指標(biāo)：pH值4.06，酸度52 °T，蛋白質(zhì)1.07%，脂肪2.13%，總固形物含量12.35%。

微生物指標(biāo)：乳酸菌活菌數(shù)4.03×109個/mL，細(xì)菌總數(shù)＜100 個/mL，大腸菌群＜3 MPN/100 mL，霉菌、酵母菌、致病菌未檢出。

3 結(jié)論

通過產(chǎn)品配方正交試驗和感官評價，確定開菲爾酸乳飲料中CMC的添加量為0.20%，高甲氧基果膠的添加量為0.20%，蔗糖添加量為8%，發(fā)酵溫度為28 ℃制作成的開菲爾酸乳飲料酸甜適中，口感清爽，在保質(zhì)期內(nèi)狀態(tài)穩(wěn)定，無蛋白沉淀及乳清析出現(xiàn)象。

[1]毛 健，王 豪，蘇米亞，等.開菲爾中生物活性物質(zhì)的益生作用[J].中國乳品工業(yè)，2010，38（12）：30-35.

[2]劉 慧，李平蘭，張永春，等.開菲爾的生理功能、特性及其產(chǎn)品開發(fā)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2005，26（4）：252-254.

[3]CARROTE G L,ABRAHAM A G,DE ANTONI G L.Chemical and microbiological characterisation of kefir grains[J].J Dairy Res,2001,68(4):639-652.

[4]顧瑞霞，謝繼志.乳酸菌與人體保健[M].北京：科學(xué)出版社，1995.

[5]郭本恒.酸奶[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.

[6]劉 麗，蔡云升.調(diào)配型酸乳飲料穩(wěn)定劑及其穩(wěn)定性的研究[J].食品工業(yè)科技，2005（5）：63-64.

[7]駱承庠.乳與乳制品工藝學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999.

[8]王 晴，王 宇，韓建榮，等.開菲爾發(fā)酵乳發(fā)酵參數(shù)變化趨勢[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（11）：189-191.

[9]王麗杰，李 巖，王洪洋，等.綠豆茶乳酸發(fā)酵飲料的研究[J].中國釀造，2010，29（12）：167-169.

[10]潘道東，徐德闖.Lactobacillus helveticusJMC 1004 發(fā)酵乳抗高血壓特性研究[J].營養(yǎng)學(xué)報，2005（3）：101-103.

[11]GUZEL-SEYD M Z B,SEYDM A C.Comparison of amino acidprofiles of milk,yogurt and kefir grain[J].Milchwissenschaft,2003,58(3/4):158-160.

[12]SCHOEVERS A,BRITZ T J.Influence of different culturing conditions on kefir grain increase[J].Int J Dairy Technol,2003,56(3):183-187.

[13]DOBSON A,O'SULLIVAN O,COTTER P D,et al.High-throughput sequence-based analysis of the bacterial composition of kefir and an associated kefir grain[J].FEMS Microbiol Lett,2011,320(1):56-62.

[14]孫明日，趙 軍，趙山林.酸性乳飲料穩(wěn)定性的研究[J].中國乳品工業(yè)，1999，27（1）：19-21.

[15]張 燕.果膠在發(fā)酵型酸性乳飲料鐘的應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，28（12）：45-47.