陳 帥，王慧竹，朱 琳，王 冠，鐘方麗*

（1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132002；2.沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

0 引言

千斤拔隸屬于豆科（Leguminosac）蝶形花亞科（Papilionoideae），《中華人民共和國藥典》一部中收載千斤拔為豆科植物蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.et Rolfe）Li.、大葉千斤拔Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze 或銹毛千斤拔Moghania ferruginea（Wall.ex Benth.）Li.的干燥根[1]，廣泛分布于我國的東南、中南、西南地區(qū)，其中蔓性千斤拔在11 個省區(qū)均有分布，大葉千斤拔在除湖北、湖南外的9 個省區(qū)均有分布.《中藥大辭典》記載“千斤拔味甘辛，微苦，性溫平，無毒，具有祛風(fēng)利濕、消瘀解毒之功效，可治療風(fēng)濕痹痛，慢性腎炎、跌打損傷、癰腫和喉蛾等癥”[2].國內(nèi)外學(xué)者對千斤拔化學(xué)成分及生物活性的研究報道很多，其化學(xué)成分主要含有黃酮類、香豆素類、萜類、揮發(fā)油、甾醇類等，其中以黃酮類化合物為主[3-5]，現(xiàn)代藥理研究及臨床試驗表明千斤拔總黃酮不僅對各種婦科炎癥有顯著療效，還具有類雌激素作用以及良好的抗血栓、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化的作用，對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷也具有一定的保護(hù)作用[6-8].因此，研究千斤拔總黃酮的提取技術(shù)在心腦血管疾病及婦科病的新藥研制方面有著比較大的開發(fā)空間及市場需求，必將會帶來良好的經(jīng)濟(jì)與社會效益.

從中藥中提取總黃酮的傳統(tǒng)提取方法有有機(jī)溶劑熱回流提取法、室溫浸提法、索氏提取法等，微波輔助萃取技術(shù)近年來廣泛應(yīng)用于中藥活性成分的提取，相對于傳統(tǒng)的提取方法具有萃取時間短，溶劑用量少，提取效率高，產(chǎn)品質(zhì)量好，成本低等優(yōu)點(diǎn)[9]，基于乙醇與無機(jī)鹽形成的雙水相體系與傳統(tǒng)的雙水相體系相比，成本更低，并且萃取相不含黏度大、難處理的聚合物，同時可表現(xiàn)出良好的分離性能[10].通過檢索文獻(xiàn)未發(fā)現(xiàn)有關(guān)采用雙水相提取千斤拔總黃酮的報道，為此，本試驗對輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取千斤拔中總黃酮的提取條件進(jìn)行了研究，以期為千斤拔總黃酮在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用及有關(guān)千斤拔新藥的研發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

TU-1950 紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任有限公司；SHZ-D 循環(huán)水真空泵：河南鞏義市英峪儀器廠；RE-3000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；KQ250 超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；MAS-Ⅱ微波合成萃取反應(yīng)儀：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；FA2204B 電子天平：上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；RT-08 多功能粉碎機(jī)：榮聰精密科技有限公司.

1.2 材料與試劑

千斤拔藥材：吉林市吉林大藥房，經(jīng)筆者鑒定為蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.et Rolfe）Li.的根；蘆丁對照品：中國藥品生物制品檢定所；乙醇、硫酸銨：均為分析純.

1.3 試驗方法

1.3.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系的建立

準(zhǔn)確配制一定濃度的硫酸銨水溶液，吸取一定體積于50 mL 比色管中，然后用無水乙醇滴定至刻度，確保溶液混合后分相，即得50 mL 乙醇-硫酸銨雙水相體系的混合液.

1.3.2 對照品溶液的制備

精確稱量蘆丁對照品10.0 mg，置于50 mL 容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容即得質(zhì)量濃度0.2 mg/mL 的蘆丁對照品溶液.

1.3.3 供試品溶液的制備

取千斤拔粉末1.0 g 置于100 mL 具塞錐形瓶中，加入50 mL 乙醇-硫酸銨雙水相體系混合溶液，靜置40 min，按既定條件進(jìn)行微波提取后，過濾，濾液轉(zhuǎn)入60 mL 分液漏斗中，待完全分相后，取上清液，減壓回收溶劑后，以60%乙醇溶液定容至25 mL 容量瓶中，搖勻，即得供試品溶液.

1.3.4 線性關(guān)系的考察

精確量取蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 分別置于10 mL 容量瓶中，然后分別加入5 %亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min 后，加10%硝酸鋁0.4 mL，放置6 min 后，再分別加4 %氫氧化鈉4 mL，用60%乙醇定容，搖勻，放置15 min后，在504 nm 處測定吸光度A，以濃度C 為橫坐標(biāo)，以吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=9.068 C＋0.001 2，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，結(jié)果表明蘆丁在20～100 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好.

1.3.5 總黃酮得率的測定

精確吸取“1.3.3”中供試品溶液1 mL，置于10 mL 容量瓶中，60%乙醇溶液定容.按“1.3.4”方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算總黃酮濃度，并按公式（1）計算總黃酮得率.

1.3.6 單因素試驗

以乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨加入量、微波時間、微波功率為主要影響因素進(jìn)行單因素試驗，考察各個因素對千斤拔總黃酮得率的影響.

1.3.6.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響

固定硫酸銨加入量為0.3 g/mL，微波時間為10 min，微波功率為500 W，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（29%、33%、38%、41%、44%）對總黃酮得率的影響.

1.3.6.2 硫酸銨加入量對總黃酮得率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為41%，微波時間為10 min，微波功率為500 W，考察硫酸銨加入量（0.2 g/mL、0.25 g/mL、0.3 g/mL、0.35 g/mL、0.4 g/mL）對總黃酮得率的影響.

1.3.6.3 微波時間對總黃酮得率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為41%，硫酸銨加入量為0.25 g/mL，微波功率為500 W，考察微波時間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）對總黃酮得率的影響.

1.3.6.4 微波功率對總黃酮得率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為41%，硫酸銨加入量為0.25 g/mL，微波時間為15 min，考察微波功率（300 W、400 W、500 W、600 W、700 W）對總黃酮得率的影響.

1.3.7 試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨加入量、微波時間、微波功率4 個因素為自變量，以總黃酮得率為響應(yīng)值，根據(jù)CCD（Central Composite Design）試驗設(shè)計原理，設(shè)計4 因素3 水平響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝[12-13]，以-1、0、1 編碼自變量低、中、高水平，因素與水平見表1.

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

單因素試驗結(jié)果和響應(yīng)面試驗結(jié)果采用SAS9.4 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，文中所有圖表采用Origin 9.2 軟件進(jìn)行繪制.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響

從圖1 可以看出，總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為41%時總黃酮得率最大，之后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，總黃酮得率呈下降趨勢，為了進(jìn)一步考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為38%、41%、44%進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計.

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield

2.1.2 硫酸銨加入量對總黃酮得率的影響

從圖2 可以看出，隨著硫酸銨加入量的增大，總黃酮得率呈上升趨勢，當(dāng)加入量為0.25 g·mL-1時，得率達(dá)到最大值，隨后隨加入量的繼續(xù)增加總黃酮得率呈下降趨勢.為了進(jìn)一步考察硫酸銨加入量對總黃酮得率的影響，選擇硫酸銨加入量為0.2 g·mL-1、0.25 g·mL-1、0.3 g·mL-1進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計.

2.1.3 微波時間對總黃酮得率的影響

從圖3 可以看出，微波時間對千斤拔總黃酮得率的影響很大，開始時總黃酮得率隨微波時間的延長而增大，當(dāng)微波時間為15 min 時，得率達(dá)到最大值，之后微波時間繼續(xù)延長，但總黃酮得率反而下降.可能是由于提取時間的延長增加了其他非黃酮類化合物的溶出.為了進(jìn)一步考察微波時間對總黃酮得率的影響，選擇微波時間10 min、15 min、20 min 進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計.

圖2 硫酸銨加入量對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of addition amount of ammonium sulfate on total flavonoids yield

圖3 微波時間對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of microwave time on total flavonoids yield

2.1.4 微波功率對總黃酮得率的影響

從圖4 可以看出，總黃酮得率隨微波功率的增加呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)微波功率達(dá)到500 W 時，總黃酮得率最高，為了進(jìn)一步考察微波功率對總黃酮得率的影響，選擇微波功率400 W、500 W、600 W 進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計.

圖4 微波功率對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on total flavonoids yield

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

利用SAS9.4 軟件對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析[10]，得到以總黃酮得率Y 為響應(yīng)值，自變量為乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、硫酸銨加入量（B）、微波時間（C）、微波功率（D）的多元二次回歸方程：Y=-24.03+104.20A-9.04B-0.17C+0.03D-173.53A2+170.42AB+0.34AC+0.002 7AD-129.97B2+0.13BC+0.006 6BD-0.007 6C2+0.000 551CD-0.000 042D2.對此回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗及方差分析，結(jié)果見表3 和表4.

由表3 可知，各因素對總黃酮得率的影響顯著順序為：乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波時間＞微波功率，三者的P 值都小于0.01，均達(dá)到了極其顯著水平，因素硫酸銨加入量的P＞0.05，因此硫酸銨加入量對總黃酮得率的影響不顯著.從表3 還可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)與硫酸銨加入量的交互作用和微波時間與微波功率的交互作用對總黃酮得率的影響顯著.由表4 可知：回歸方程的P＜0.000 1，說明回歸方程的總模型對總黃酮得率的影響均極其顯著[14-15]；方程的決定系數(shù)為0.960 8，說明響應(yīng)值的變化有96.08%來源于所選變量，模型擬合度好，失擬項P＞0.05，說明回歸模型中無失擬因素存在，因此回歸方程可以較準(zhǔn)確地描述各試驗因素與總黃酮得率之間的關(guān)系.

表2 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果Table 2 Scheme and experimental results of response surface design

表3 回歸方程參數(shù)值及顯著性檢驗Table 3 Significance test for the estimation of fitted regression

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Variance analysis of the fitted quadratic polynomial

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

為了更加直觀地表達(dá)兩個因素同時對總黃酮得率的影響，固定兩個因素的值為零水平對應(yīng)的值，僅考慮另外兩個因素對總黃酮得率的影響，根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖，結(jié)果如圖5 所示，從圖5 可以直觀地看出各因素對總黃酮得率的影響，曲面越陡峭，表明總黃酮的得率受該因素影響較大；從等高線可以看出最佳的提取工藝的條件在圓心處[16-19].從圖5 可以看出，對總黃酮得率影響比較大的因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)，其次為微波時間和微波功率，乙醇體積分?jǐn)?shù)與硫酸銨的交互作用和微波時間與微波功率的交互作用對總黃酮得率的影響顯著，這與表3 的分析結(jié)果相吻合.

利用SAS 軟件RSREG 語句對模型進(jìn)行典型性分析，得到微波輔助雙水相法提取千斤拔總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)41.25%、硫酸銨加入量0.28 g·mL-1、微波時間20.81 min、微波功率553.56 W，在此工藝條件下總黃酮得率預(yù)測值為6.67 %，但考慮到實(shí)際情況，將最佳工藝條件修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)41%、硫酸銨加入量0.28 g·mL-1、微波時間21 min、微波功率550 W.在此修正工藝條件下進(jìn)行驗證試驗，重復(fù)5 次，結(jié)果如表5 所示.

表5 千斤拔總黃酮最佳提取工藝驗證試驗結(jié)果Table 5 The experimental results of extracting total flavonoids under the optimum extraction process

圖5 因素交互作用對總黃酮得率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 Response surface plot and contour line of the effect of interaction of factors on the extraction yield of total flavonids

由表5 可以看出，5 次工藝驗證試驗的總黃酮平均得率為6.64%，平均得率與理論得率的差值僅占理論得率的0.45%，由此可知回歸模型較好地反映了總黃酮的提取工藝條件，同時也說明了該最佳工藝條件的穩(wěn)定性，并且與文獻(xiàn)[20]報道的超聲波輔助乙醇回流法提取千斤拔總黃酮的工藝相比（總黃酮得率3.0%），微波輔助雙水相法提取總黃酮的得率更高.

3 結(jié)論

本文采用微波輔助雙水相法提取千斤拔總黃酮，以總黃酮得率為響應(yīng)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨加入量、微波時間、微波功率為考察因素，利用響應(yīng)面法對總黃酮提取工藝的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明，千斤拔總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)41%、硫酸銨加入量0.28 g·mL-1、微波時間21 min、微波功率550 W，在此工藝條件下千斤拔總黃酮的實(shí)際得率為6.64%，與理論預(yù)測值接近，并且高于文獻(xiàn)報道的采用超聲波輔助乙醇回流提取千斤拔中總黃酮的得率，因此可以利用響應(yīng)面法優(yōu)化雙水相輔助微波法提取千斤拔總黃酮，試驗得到的最佳工藝條件對千斤拔總黃酮在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用及有關(guān)千斤拔新藥的研發(fā)提供了理論依據(jù).

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