王 艷 金 強(qiáng) 馮一峰 王 德 王新建 高疆生*

(1 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300)(2 塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)(3 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

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新疆早實(shí)核桃花粉離體培養(yǎng)基的篩選

王 艷1,2金 強(qiáng)1,3馮一峰1,2王 德1,2王新建1,2高疆生1,2*

(1 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300)(2 塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)(3 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

以早實(shí)核桃“新溫179”花粉為試材，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)選花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基成分不同濃度條件及最適溫度和PH值，結(jié)合藍(lán)墨水染色法、I-KI染色法、TTC活力測(cè)定法、醋酸洋紅染色法4種染色法預(yù)測(cè)花粉生活力，為早實(shí)核桃遺傳改良中間材料夯實(shí)研究基礎(chǔ)。結(jié)果表明:5個(gè)因素影響核桃花粉萌發(fā)率的主次關(guān)系依次為:蔗糖>硼酸>溫度>氯化鈣>PH值,核桃花粉離體培養(yǎng)基主要成分最佳組合為蔗糖20%+硼酸0. 05%+氯化鈣0. 002%，最適溫度為30 ℃，最適PH值為6. 5。

早實(shí)核桃； 正交設(shè)計(jì)； 花粉； 離體培養(yǎng)

新疆核桃(Juglans regia L.)栽培歷史悠久，是我國(guó)珍貴的木本油料植物之一，以其個(gè)大、殼薄、外形美觀、早實(shí)、豐產(chǎn)、含油率高、適應(yīng)性強(qiáng)而馳名全國(guó)[1]。早實(shí)核桃是新疆核桃主產(chǎn)區(qū)推廣的主栽品種，對(duì)新疆核桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有舉足輕重的作用[2]。發(fā)展核桃產(chǎn)業(yè),良種是基礎(chǔ),核桃良種選育一直是國(guó)內(nèi)外非常重視的研究課題。雜交育種是提高核桃產(chǎn)量和改良核桃品質(zhì)的重要手段[3]，而花粉生活力強(qiáng)弱是果樹雜交育種工作成敗的關(guān)鍵,花粉生活力的保持,對(duì)進(jìn)行遠(yuǎn)距離雜交育種更具有重要意義。適宜的檢測(cè)父本花粉活力是獲得高質(zhì)量花粉的重要技術(shù)保障，花粉離體萌發(fā)試驗(yàn)可以有效的檢測(cè)花粉活力[4]。影響花粉離體萌發(fā)的因素較多,只有在含有適宜的礦物質(zhì)、糖類等組分的條件下,花粉才能萌發(fā)[5]。在選擇花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的最佳組成時(shí),除了可以參考和借鑒已有的工作經(jīng)驗(yàn)外,往往還要依靠大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選。這不僅耗費(fèi)時(shí)間與精力,而且篩選出來的組合常常并不能代表最佳組合,因而帶有一定的盲目性。

正交設(shè)計(jì)是多因素多水平分析的有效工具,當(dāng)要從多因素中選出主要因素時(shí),使用正交設(shè)計(jì)可以用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)獲得較多的信息,可以精簡(jiǎn)實(shí)驗(yàn)次數(shù)[6]。本試驗(yàn)以“新溫179”為研究材料,利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化核桃花粉萌發(fā)條件,結(jié)合藍(lán)墨水染色法、TTC活力測(cè)定法、I-KI染色法、醋酸洋紅染色法4種染色法預(yù)測(cè)花粉生活力，篩選其花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基,旨在為核桃雜交育種及遺傳改良中間材料創(chuàng)制鋪墊研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試材采自溫宿縣木本糧油核桃林場(chǎng)(東經(jīng)80°14′，北緯40°16′)十二年生“新溫179”大樹。實(shí)驗(yàn)主要涉及儀器有顯微鏡、光照培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)所用主要試劑有TTC、I-KI、醋酸洋紅、蔗糖、硼酸、氯化鈣等。

1.3 方法

1.3.1 花粉處理

在核桃雄花初花期,采集其雄花序,摘除已開的花朵,帶回實(shí)驗(yàn)室,用清水沖洗花序,鋪在白紙上陰干后,自然散粉,收集于潔凈的瓶子封口，貯藏在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 染色法預(yù)測(cè)花粉生活力

用藍(lán)墨水染色法[7]、I-KI染色法[8]、TTC活力測(cè)定法[8]、醋酸洋紅染色法[9]4種方法測(cè)定核桃花粉生活力。每種方法設(shè)3次重復(fù),每重復(fù)觀察5個(gè)視野,每個(gè)視野觀察約100?；ǚ?計(jì)算平均值?；ǚ凵盍?著色花粉數(shù)/觀察花粉總數(shù)*100%

1.3.3 花粉萌發(fā)培養(yǎng)基篩選

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì):用DPS軟件設(shè)計(jì)蔗糖、硼酸、氯化鈣、溫度、PH值五個(gè)因子五個(gè)水平的正交試驗(yàn),并對(duì)各個(gè)處理組合的結(jié)果和各因素進(jìn)行方差分析。篩選出蔗糖、硼酸、氯化鈣、溫度和PH值的最佳組合。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

花粉培養(yǎng)與觀察：將1g瓊脂倒入錐形瓶中,加入100ml蒸餾水、加熱溶解,再按照小組設(shè)計(jì)分別加入0%、5%、10%、20%、30%的蔗糖，0%、0. 005%、0. 01%、0. 05%、0. 1%的硼酸和0%、0. 002%、0. 004%、0. 006%、0. 008%的氯化鈣于瓶中溶解混勻,倒入相應(yīng)編組的培養(yǎng)皿中。待冷卻后,用棉簽沾取少量花粉置于培養(yǎng)皿上方，用洗耳球?qū)⒒ǚ劬鶆驀娫诠腆w培養(yǎng)基上。每種培養(yǎng)基重復(fù)4次,將培養(yǎng)皿放在設(shè)定的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),24h后在顯微鏡下觀察。在顯微鏡下檢查生活力狀況,每種培養(yǎng)基觀察10～20個(gè)視野,每個(gè)視野100～200?；ǚ?共觀測(cè)約2 000?；ǚ?。有花粉管的花粉粒為有生活力的花粉,無花粉管的花粉粒為無生活力的花粉,計(jì)算有生活力花粉粒的百分率平均值。萌發(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)/觀察花粉總數(shù)*100%。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

用DPS軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)方差分析，采用新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色法預(yù)測(cè)花粉生活力

圖1 四種染色法測(cè)定花粉生活力狀況

注：大寫字母表示5%顯著水平

一般情況下，染色法是檢測(cè)花粉生活力最簡(jiǎn)便快速的方法。從圖1可以看出四種染色法測(cè)定的核桃花粉生活力存在顯著差異。醋酸洋紅所測(cè)的花粉生活力達(dá)到84. 31%，顯著高于其它三種染色方法，這可能與其染色的原理有關(guān)[9]；I-KI染色法測(cè)得的花粉生活力最低，顯著低于其它三種染色方法，僅為39. 29%，這可能是核桃花粉中所含的淀粉較少或其花粉壁較厚造成的[8]；藍(lán)墨水染色法和TTC活力測(cè)定法測(cè)得的花粉生活力較為接近，兩者之間無顯著性差異，和姜雪婷、劉寶等人[10，11]的研究結(jié)論一致，可以作為測(cè)定核桃花粉生活力的染色法。利用染色法進(jìn)行花粉生活力的檢測(cè)具有方便快捷的優(yōu)點(diǎn),且能夠在一定程度上反映花粉的生活力,但染色法測(cè)定花粉活力受花粉自身特性,如花粉內(nèi)各種酶活性的強(qiáng)弱、花粉壁的薄厚、細(xì)胞質(zhì)含量、質(zhì)膜的完整性及組成物質(zhì)等因素的影響較大,因此不同的染色法適合不同植物花粉生活力的測(cè)定。

2.2 正交設(shè)計(jì)法篩選花粉萌發(fā)培養(yǎng)基

從表2并結(jié)合圖2可以看出，在不同濃度的培養(yǎng)液條件下,早實(shí)核桃“新溫179”花粉均能萌發(fā),但不同條件下花粉萌發(fā)率各不相同。其中,A5B1C5D4E3組合的萌發(fā)率最低,僅為0. 57%；而A4B4C2D5E3組合培養(yǎng)基條件下花粉萌發(fā)率最高，達(dá)45. 07%，這與藍(lán)墨水染色法和TTC活力測(cè)定法測(cè)得的花粉萌發(fā)率基本相符。因素內(nèi)水平極差(R)的大小可反應(yīng)該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度。由表2可知,參試的5個(gè)因素對(duì)核桃花粉萌發(fā)率影響的主次關(guān)系依次為:A>B>D>C>E。由此可知,蔗糖濃度對(duì)花粉的萌發(fā)影響最大,硼酸濃度次之,而PH值濃度影響最小。從圖2可以看出，不同濃度蔗糖條件下花粉發(fā)芽率大小依次為A4(Ⅰ)>A3(Ⅱ)>A2(Ⅲ)>A1(Ⅳ)>A5(Ⅴ)；且根據(jù)各因素水平均值(Ki)的大小,得各影響因素下“新溫179”花粉萌發(fā)率大小依次為A(K4>K3>K2>K5>K1)>B(K4>K5>K3>K2>K1)>C(K2>K3>K4>K1>K5)>D(K5>K4>K1>K3>K2)>E(K3>K2>K4>K1>K5)，由此可得知“新溫179”花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的最佳組合為A4B4C2D5E3，即蔗糖20%、硼酸0. 05%、氯化鈣0. 002%、溫度30℃和PH值6. 5。

圖2 正交設(shè)計(jì)培養(yǎng)基條件下不同濃度蔗糖培養(yǎng)的花粉發(fā)芽狀況

表2 花粉萌發(fā)的正交設(shè)計(jì)L25(56)試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

在雜交育種及遺傳改良中間材料的實(shí)施過程中,研究花粉的生活力和育性是必不可少的基礎(chǔ)性工作。花粉活力預(yù)示著植物受精后將精細(xì)胞送往子房的能力。為保證人工授粉的成功率，授粉前確定花粉活力非常重要?；ǚ廴旧珳y(cè)定法和花粉萌發(fā)測(cè)定法均能檢測(cè)果樹的花粉生活力[12]。由于染色法只能反映花粉的代謝情況或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，且顏色判斷誤差較大，只是對(duì)花粉生活力的間接檢測(cè)，并不能直接準(zhǔn)確地表現(xiàn)花粉的實(shí)際萌發(fā)率[11]，而花粉離體萌發(fā)法提供的條件與花粉在柱頭萌發(fā)的條件更為接近，是檢測(cè)花粉生活力最為可靠的方法[13]。

在花粉離體培養(yǎng)的工作中,培養(yǎng)基的組成具有重要的作用。正交設(shè)計(jì)是多因素多水平分析的可靠工具,可用最少的處理組合研究較多的試驗(yàn)因素,已在花卉、蔬菜、菌體發(fā)酵液和一些果樹的組織培養(yǎng)等方面已有一定的研究[14-17]，但在核桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)研究中應(yīng)用的報(bào)道不多[13，18]。

本試驗(yàn)成功的將正交設(shè)計(jì)應(yīng)用在了探究核桃花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基上，確立了適宜核桃“新溫179”花粉離體萌發(fā)的條件,并與染色測(cè)定法結(jié)合，篩選出了適合快速準(zhǔn)確測(cè)定核桃花粉生活力的藍(lán)墨水染色法和TTC活力測(cè)定法的兩種染色測(cè)定法，可用于雜交育種前的花粉活力檢測(cè)。但對(duì)于溫度對(duì)花粉萌發(fā)影響的峰值確定還有待驗(yàn)證。

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Orthogonal Optimization of Pollen Germinating Culturel Medium in Vitro from Precocious Walnut in Xinjiang

Wang Yan1,2Jin Qiang1,3Feng Yifeng1,2Wang De1,2Wang Xinjian1,2Gao Jiangsheng1,2*

(1 Key Laboratory of Biological Resource Protection and Utilization of Tarim Basin, Xinjiang Production & Construction Group，Alar，Xinjiang 843300)

(2 College of Plant Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

(3 College of Life Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

The pollen of precocious walnut “Xin Wen 179” as material, using the orthogonal design, the optimal selected walnut pollen germinating in vitro culture medium under the condition of different concentration of sucrose, boric acid and calcium chloride, and the optimum temperature and PH value, combined with blue ink staining and I - KI dyeing method, TTC activity assay method, carmine acetate dyeing method, four kinds of method to predict pollen viability for the research of walnut cross breeding. The results showed that the five factors which affected the pollen germination in the order was as follow, sucrose > boric acid>temperature>calcium chloride> PH value, the best combination of walnut pollen in vitro culture medium ingredients was 20% sucrose , 0. 05% boric acid and 0.002% calcium chloride, the optimum temperature was 30 ℃ with the optimum PH of 6.5.

Precocious Walnut;Orthogonal design;Pollen;In vitro culture

2014-11-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260463)；塔里木大學(xué)校長(zhǎng)基金碩士項(xiàng)目(TDZKSS1001); 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2011BA003)。

王艷(1987-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡浞N質(zhì)資源。E-mail:371446391@qq.com

E-mail： gjs_201@sina.com

1009-0568(2015)02-0028-06

S

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2015.02.006