呂鵬翼，崔建升

河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院河北省污染防治生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050018

水體中葉綠素a含量是表征浮游植物生物量的一個(gè)重要指標(biāo)［1］，當(dāng)前以熒光原理為基礎(chǔ)，浮游植物中葉綠素a含量在線快速檢測裝置的研發(fā)已成為環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一［2-4］。理論上關(guān)于溫度對離體葉綠素a測定結(jié)果的影響研究已相對成熟，已知高溫條件下葉綠素a不穩(wěn)定、易降解［5-7］;許金鉤等［8］在所著的《熒光分析法》中指出溫度對熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度有顯著的影響，一般熒光物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率和熒光強(qiáng)度會隨著溫度的降低而升高。在現(xiàn)場測定環(huán)境中熒光儀測定對象主要為活體藻中的葉綠素a，一般不同季節(jié)、一天中不同時(shí)間段水體的溫度會有所差異，故溫度會對活體藻中葉綠素a的測定產(chǎn)生一定影響。有研究［9-10］報(bào)道，天然海水中活體藻在12～30℃范圍內(nèi)，溫度每升高1℃，熒光降低1.4%。廈門市環(huán)境監(jiān)測中心站［11］采用YSI葉綠素傳感器探頭對廈門西港葉綠素含量進(jìn)行監(jiān)測，在肯定葉綠素水質(zhì)自動監(jiān)測儀輕便、操作簡單、維護(hù)量小、可進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)也指出葉綠素傳感器易受溫度的影響。Catherine等［12］使用德國bbe葉綠素在線分析儀對法國境內(nèi)的大量湖泊、水庫進(jìn)行了大規(guī)模的測量，結(jié)果表明通過對水體中葉綠素 a的測定分析能夠很好地估算浮游植物的生物量，但同時(shí)指出溫度等環(huán)境因素會對葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)生怎樣的影響仍需要進(jìn)行深入研究。以往研究多側(cè)重溫度升高對熒光法測定葉綠素a的直觀影響且實(shí)驗(yàn)對象多為葉綠素a萃取液［5］，關(guān)于溫度對熒光法測定活體藻中葉綠素a的影響的研究少見報(bào)道。對此，分別以純?nèi)~綠素a和活體藻為實(shí)驗(yàn)對象研究了溫度對熒光法測定葉綠素a的影響，首次提出了不同狀態(tài)下葉綠素a(離體葉綠素a和活體藻中的葉綠素a)的溫度系數(shù)，并測試了溫度對自主研發(fā)的水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀的影響，對水體葉綠素在線監(jiān)測系統(tǒng)的完善具有一定的理論意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF5301熒光分光光度計(jì)(日本)，水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀，HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋。

葉綠素 a標(biāo)準(zhǔn)品(10 mg，日本)，銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa，BG-11培養(yǎng)基)，90%乙醇。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RF5301熒光分光光度計(jì)

1)取葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品用90%乙醇配制濃度為1.0 μg/mL的葉綠素 a樣品置于恒溫水浴鍋中在60℃條件下恒溫20 min后立即將樣品取出，用熒光分光光度計(jì)在“Time Course”模式下連續(xù)測定10 min，采樣間隔和采樣點(diǎn)自動設(shè)定。

2)取葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品用90%乙醇配制濃度為0.50 μg/mL的葉綠素 a樣品，測定不同溫度水平(20、30、40、50、60、70 ℃)下樣品的熒光強(qiáng)度值并求其降解率。

3)取葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品以90%乙醇為溶劑，分別 配 制 一 定 濃 度 梯 度 (0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL)的純品葉綠素a樣品系列，設(shè)置樣品測定溫度范圍為5～70℃，按照從低溫到高溫的順序依次測定相同濃度的葉綠素a樣品的熒光強(qiáng)度值。分析溫度對不同濃度的葉綠素a的影響是否具有一致性，并計(jì)算出葉綠素a的溫度系數(shù)。

4)一般不同水體所含浮游藻類的種類不同，為更好地表征溫度對實(shí)際水體中活體藻的影響，選取水體中的銅綠微囊藻、斜生柵藻、蛋白核小球藻為實(shí)驗(yàn)藻種。分別取其配制不同濃度的活體藻樣品，設(shè)置實(shí)驗(yàn)溫度范圍為10～70℃，溫度間隔為5℃，每個(gè)樣品恒溫20 min后測定其熒光強(qiáng)度值，并求其溫度系數(shù)。

RF5301熒光分光光度計(jì)測定葉綠素a的參數(shù)設(shè)置為激發(fā)波長 436.0nm，發(fā)射波長672.0 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5.0 nm。

1.2.2 水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀

配制濃度為60 μg/L的葉綠素a樣品，將水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀與待測樣品同時(shí)置于恒溫水浴鍋，調(diào)節(jié)溫度以使溶液溫度與水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀溫度相同，模擬自然測定環(huán)境。設(shè)置溫度范圍為15～40℃，溫度間隔為1℃。研究溫度對水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀測定結(jié)果的影響，確定檢測儀最佳測定溫度范圍。

水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀測定條件為“連續(xù)測量”模式，測量間隔30 s，每個(gè)樣品連續(xù)測量10 min，取其平均值。

在實(shí)驗(yàn)過程中樣品均為現(xiàn)測現(xiàn)配，在測定過程中待測樣品需避光放置，避免葉綠素a發(fā)生光解。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對葉綠素a熒光強(qiáng)度的影響

圖1為葉綠素a的熒光強(qiáng)度值隨時(shí)間的變化趨勢。

圖1 葉綠素a的熒光強(qiáng)度值隨時(shí)間的變化趨勢

隨著時(shí)間的延長，樣品溫度會逐漸降低至室溫(約20℃)，葉綠素a樣品的熒光強(qiáng)度隨著溫度降低呈上升趨勢，當(dāng)樣品溫度達(dá)到室溫后熒光強(qiáng)度值基本趨于平緩。

不同溫度水平下葉綠素a樣品的熒光強(qiáng)度值如表1所示。

表1 不同溫度水平下葉綠素a樣品的熒光強(qiáng)度值及降解率

由表1可見，以20℃條件下測定的熒光強(qiáng)度值為對照組，隨著溫度的升高葉綠素a的降解程度加大。30℃時(shí)葉綠素a的降解率為2.34%;當(dāng)溫度為70℃時(shí)，葉綠素a的降解率達(dá)到10.08%左右，說明溫度對葉綠素a降解程度有顯著影響。

不同濃度葉綠素a樣品的熒光強(qiáng)度隨溫度的變化情況如圖2所示。

圖2 不同濃度葉綠素a樣品的熒光強(qiáng)度值隨溫度的變化情況

由圖2可見，隨著溫度的升高葉綠素a樣品的熒光強(qiáng)度值總體呈下降趨勢，不同濃度的樣品均符合此變化規(guī)律。分析原因主要有2方面:①溫度的升高使部分葉綠素a降解生成了以脫鎂葉綠素a為主的降解產(chǎn)物，兩者熒光特性有所差異，從而降低了葉綠素a的熒光量子產(chǎn)率;②由于溫度升高提高了分子動能，促進(jìn)了分子間流動，使液體動力增加粘度減小，增大了熒光分子和溶劑分子的碰撞機(jī)會，熒光物質(zhì)分子通過其他分子的碰撞造成內(nèi)部能量的轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致溫度淬滅，降低了熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。

為更清楚直觀地觀察葉綠素a的熒光強(qiáng)度隨溫度的變化情況，取濃度為1.0 μg/mL樣品系列進(jìn)行具體分析。圖3為5～70℃范圍內(nèi)葉綠素a樣品熒光強(qiáng)度隨溫度的變化情況。

圖3 5～70℃范圍內(nèi)1.0 μg/mL葉綠素a樣品的熒光強(qiáng)度值隨溫度變化示意圖

由圖3可知，在5～20℃溫度范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度值隨溫度的升高下降幅度較小，即低溫條件下葉綠素a降解率較低且低溫狀態(tài)下溫度對葉綠素a分子能量轉(zhuǎn)移影響較小，溫度淬滅效應(yīng)不顯著。在20～50℃范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度值與溫度呈良好的負(fù)線性相關(guān)，回歸方程為y=－0.893x+307.82，回歸系數(shù)為0.999 5;在50℃左右時(shí)，1.0 μg/mL葉綠素a樣品的熒光強(qiáng)度與溫度的關(guān)系曲線出現(xiàn)了拐點(diǎn)，變化趨于平穩(wěn)。

2.2 葉綠素a溫度系數(shù)實(shí)驗(yàn)

一般而言，熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度隨溫度的降低而增強(qiáng)，溫度的升高與熒光強(qiáng)度的減弱在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。溫度每升高1℃，熒光減弱的百分?jǐn)?shù)稱為其溫度系數(shù)，不同熒光物質(zhì)的溫度系數(shù)不同。計(jì)算葉綠素a的溫度系數(shù)(TC)，如式(1)所示。不同濃度葉綠素a樣品的溫度系數(shù)列于表2。由表2可以看出，葉綠素a溫度系數(shù)在0.29% ～0.30%之間變動，取其平均值(0.295%)為葉綠素a的溫度系數(shù)。該值反映的是葉綠素a的熒光強(qiáng)度隨溫度變化的特性。

式中:TC為葉綠素a的溫度系數(shù);T1、T2為不同的測定溫度;F1為葉綠素a在T1溫度下的熒光值;F2為葉綠素a在T2溫度下的熒光值。

表2 不同濃度葉綠素a樣品的溫度系數(shù)

2.3 溫度對活體藻中葉綠素a熒光強(qiáng)度的影響

圖4為不同藻類的葉綠素a熒光強(qiáng)度隨溫度的變化情況。

圖4 不同藻類的熒光強(qiáng)度隨溫度的變化情況

由圖4可知，活體藻的熒光強(qiáng)度值隨著溫度的升高同樣呈下降趨勢，與純?nèi)~綠素a相比線性關(guān)系較差，分析原因可能是與純?nèi)~綠素a相比活體藻結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，逆境環(huán)境下溫度脅迫使活體藻結(jié)構(gòu)、光合速率或葉綠體的微環(huán)境發(fā)生了改變，從而影響了葉綠素a的熒光特性［13］。

圖5為斜生柵藻、蛋白核小球藻及銅綠微囊藻在10～45℃范圍內(nèi)的原藻液熒光強(qiáng)度與溫度的關(guān)系曲線。

圖5 10～45℃范圍內(nèi)不同藻類的熒光強(qiáng)度隨溫度的變化情況

分析圖5可知，隨溫度的升高3種活體藻的熒光強(qiáng)度值均呈下降趨勢且相關(guān)系數(shù)均在0.97以上，運(yùn)用式(1)計(jì)算得斜生柵藻的溫度系數(shù)約為1.09%，蛋白核小球藻的溫度系數(shù)約為1.17%，銅綠微囊藻的溫度系數(shù)約為1.14%。

2.4 溫度對水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀測定結(jié)果的影響

溫度過高或過低均會對葉綠素a的熒光強(qiáng)度值產(chǎn)生影響，在實(shí)際測量環(huán)境中，環(huán)境溫度除對浮游植物的熒光特性產(chǎn)生影響從而降低測定結(jié)果的準(zhǔn)確性外，溫度對葉綠素?zé)晒鈨x的光電倍增管的信號輸出也會產(chǎn)生一定影響，對此采用熒光強(qiáng)度隨溫度變化的百分率作為補(bǔ)償因子對水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀進(jìn)行了溫度補(bǔ)償，以降低溫度對檢測儀的影響。

以濃度為60 μg/L的26個(gè)葉綠素 a樣品為測定對象，用水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀在15～40℃溫度范圍內(nèi)測定樣品的濃度值，設(shè)置溫度間隔為1℃。測定結(jié)果如表3所示。

表3 不同溫度水平下水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀測定值及其相對誤差

由表3可見，在15～40℃溫度范圍內(nèi)測定值與真實(shí)值的相對誤差為9.26% ～－15.45%，在15～35℃溫度范圍內(nèi)測定值與真實(shí)值的相對誤差為±10%。分析結(jié)果可知，溫度越高檢測儀測定值與真實(shí)值的相對誤差越大，測定結(jié)果偏低主要是由葉綠素a高溫降解所貢獻(xiàn);雖然對檢測儀的輸出信號進(jìn)行了溫度補(bǔ)償，但在實(shí)際測定中溫度對檢測儀的影響是難以避免的。此外，隨著溫度的升高，檢測儀測定結(jié)果整體呈下降趨勢，該結(jié)果與溫度對實(shí)驗(yàn)室熒光法測定葉綠素a的影響趨勢一致。實(shí)驗(yàn)表明，在15～35℃溫度范圍內(nèi)，水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀測定結(jié)果可取，滿足一般水體測定環(huán)境的溫度要求。

3 結(jié)論

分別以純?nèi)~綠素a和銅綠微囊藻、斜生柵藻及蛋白核小球藻3種活體藻為實(shí)驗(yàn)對象研究了不

同溫度水平下葉綠素a及活體藻的相對熒光強(qiáng)度的變化情況。結(jié)果顯示，不同狀態(tài)的葉綠素a的熒光強(qiáng)度值均會隨溫度的升高而降低，分析原因主要是由葉綠素a高溫降解和溶液粘度減小導(dǎo)致的溫度熒光淬滅所引起;不同狀態(tài)的葉綠素a溫度系數(shù)的導(dǎo)出對進(jìn)一步研究葉綠素a的熒光特性隨溫度的變化規(guī)律意義重大，對水體葉綠素現(xiàn)場檢測儀的溫度校準(zhǔn)和提高水體中葉綠素a現(xiàn)場檢測裝置的準(zhǔn)確度具有一定參考價(jià)值。

［1］王俊，李洪志．渤海近岸葉綠素和初級生產(chǎn)力研究［J］．海洋水產(chǎn)研究，2002，23(1):23-28．

［2］Gregor J， Marsalek B． Freshwater phytoplankton quantification by chlorophyll a:a comparative study of in vitro，in vivo and in situ methods［J］．Water Research，2004，38(3):517-522．

［3］Izydorczyk K，Carpentier C，Mrowczynski J，et al．Establishment of an alert level framework for cyanobacteria in drinking water resources by using the algae online analyser for monitoring cyanobacterial chlorophyll a［J］．Water Research，2009，43(4):989-996．

［4］Tammi L R，Evelyn L，James L P，et al．Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser［J］．Water Research ，2010，44(8):2 461-2 472．

［5］張武昌，王榮．光和溫度對葉綠素a和脫鎂葉綠酸a降解的影響［J］．海洋科學(xué)，2000，24(4):50-52．

［6］李翠華，張魯勉，何小英．葉綠素a降解產(chǎn)物及其衍生物應(yīng)用研究［J］．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，15(2):121-122．

［7］陰金香，楊楷．天然綠色植物中去鎂葉綠素的分離和鑒定［J］．廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003，21(z1):286-287．

［8］許金鉤，王尊本．熒光分析法［M］．3版．北京:科學(xué)出版社，2006:49-63．

［9］Lorenzen C J． A method for the continuous measurement of in vivo chlorophyll concentration［J］．Deep-Sea Res，1966，13(2):223-227．

［10］丁永耀，張欣梅，呂培頂，等．熒光法測定海中生物體內(nèi)的葉綠素 a［J］．海洋學(xué)報(bào)，1983，5(8):340-348．

［11］張江龍．葉綠素檢測儀器在水質(zhì)自動監(jiān)測應(yīng)用中的優(yōu)劣淺析［J］．現(xiàn)代科學(xué)儀器，2007(1):41-42．

［12］Catherine A，Escoffier N，Belhocine A，et al．On the use of the FluoroProbe，a phytoplankton quantification method based on fluorescence excitation spectra for large-scale surveys of lakes and reservoirs［J］．Water Research，2012，46(6):1 771-1 784．

［13］王靜．高溫、高光強(qiáng)脅迫對植物離體葉綠體光合色素的降解及沙丘蘆葦純化內(nèi)含鉚對其減緩作用的研究［D］．蘭州:蘭州大學(xué)，2008．