張繼州，韓 靜，張 寬，賀肇東，龐文生，胡 娟，3*

(1.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學附屬福建省第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；3.福建中醫(yī)藥大學 藥學院，福建 福州 350122)

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考馬斯亮藍法測定天花粉飲片水煎劑中蛋白質含量

張繼州1，韓 靜1，張 寬2，賀肇東1，龐文生2，胡 娟1，3*

(1.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學附屬福建省第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；3.福建中醫(yī)藥大學 藥學院，福建 福州 350122)

目的：測定治療腦卒中及其后遺癥的經典方栝樓桂枝湯中的君藥天花粉飲片水煎劑中蛋白質的含量。方法：采用考馬斯亮藍法，利用考馬斯亮藍染料與蛋白質中的堿性基團相結合的原理，通過分光光度計測量待測溶液吸光度，得出其蛋白濃度。結果：濃度分別為0.5g/mL和1.0g/mL的天花粉飲片水煎劑，其蛋白質含量分別為106.6μg/mL和132.6μg/mL。結論：該測定方法快捷、方便、靈敏度高，為后續(xù)研究奠定了基礎。

天花粉；栝樓桂枝湯；考馬斯亮藍法；蛋白質；含量測定

天花粉是葫蘆科植物栝樓根的切片?！侗静菥V目》稱：“栝樓根，味甘微苦酸，酸能生津，故能止渴潤枯，微苦降火，甘不傷胃?！碧旎ǚ鄣鞍?Tichosanthin，TCS)是從天花粉中提取的一組單鏈核糖體失活蛋白，具有抗孕引產、抑制腫瘤、抗病毒、免疫抑制等生理活性[1]。而天花粉作為治療腦卒中及其后遺癥的經典方栝樓桂枝湯中的君藥，對于藥效有著關鍵性的影響[2-3]?？捡R斯亮藍(Coomassie BriLLiant BLue)法又稱Bradford法，是利用蛋白質-染料結合的原理，定量測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。考馬斯亮藍G-250染料在酸性溶液中與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合，使染料最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{色。通過測定595nm處光吸收的增加量，可以得到與考馬斯亮藍結合的蛋白質的量。該測定法具有超過其他幾種方法的優(yōu)點，是目前靈敏度最高的蛋白質測定法，因而得到廣泛的應用[4]。本實驗采用考馬斯亮藍法測定天花粉飲片水煎劑中的蛋白質含量，為探究其藥理活性及臨床應用提供重要依據。

1 儀器與材料

牛血清白蛋白(北京索萊寶科技有限公司)、考馬斯亮藍G250、95%乙醇、磷酸均為國藥集團化學試劑有限公司分析純、天花粉飲片(福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂提供)、去離子水。722光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

2 試驗方法

2.1 溶液制備

2.1.1 考馬斯亮藍溶液配制 取考馬斯亮藍G-250 20mg溶于10mL 95%乙醇，混勻，加入20mL 85%磷酸，最后用去離子水定容至200mL。

2.1.2 標準蛋白質溶液配制 取2mg牛血清蛋白于去離子水中配成含蛋白質2mg/mL母液。用去離子水梯度稀釋標準蛋白質溶液，濃度分別為40、80、120、160、200μg/mL。

2.1.3 天花粉水煎劑制備 稱取藥材15、30g，分別加去離子水300mL，煎煮、濃縮成少于30mL的液體，用去離子水將濃縮液定容至30mL，獲得水煎劑中的生藥濃度為0.5g/mL、1.0g/mL。

2.2 含量測定

2.2.1 蛋白標準曲線制定 取上述配制的蛋白質溶液各600μL于干凈試管內，并標明各管濃度，每管加入考馬斯亮藍溶液3mL，混勻。以去離子水作為空白對照，用去離子水對紫外分光光度計進行校正，標準空白管調零。按蛋白質標準液濃度由低到高進行測定，每個濃度測定3次，取平均值，以蛋白質濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標作圖，繪制標準曲線。

2.2.2 天花粉飲片水煎劑蛋白質含量測定 取“2.1.3”中制得的水煎液，過濾，各取600μL于干凈試管內，加入考馬斯亮藍溶液3mL，混勻。用標準空白管進行調零。不同樣品濃度各測定3次，取平均值，根據樣品吸光度值，由“2.2.1”所得標準曲線計算出待測水煎劑蛋白濃度。

3 結果

3.1 蛋白標準曲線制定

依照“2.2.1”方法，測定濃度依次為40、80、120、160、200μg/mL標準蛋白溶液的OD值(表1)；繪制蛋白標準曲線，見圖1。其線性回歸方程式為：Y=0.004X+0.0886，R2=0.998 5。

表1 標準蛋白吸光度測定值

圖1 蛋白標準曲線

3.2 天花粉飲片水煎劑蛋白質含量測定結果

將濃度分別為0.5g/mL和1.0g/mL的天花粉飲片水

煎劑測得的吸光度OD值代入標準曲線，計算出天花粉飲片水煎劑樣品中蛋白質的含量，結果見表2。

表2 天花粉水煎劑蛋白質含量

4 討論

本研究結果所示，1.0g/mL濃度的天花粉飲片水煎劑中蛋白質的濃度為0.5g/mL濃度的1.24倍，達不到2倍的理論值，故可能存在影響水煎劑蛋白含量的因素，如蛋白質發(fā)生聚集或三級結構在水煎過程中發(fā)生改變等,有待進一步探究。

[1] 王飛 ,丁玉,陳明達,等.天花粉蛋白的純化技術進展及其藥理概況[J].安徽農業(yè)科學，2010,38(1):29-30,41.

[2] 陳瑛玲,陳立典，陶靜.栝樓桂枝湯治療中風后肢體痙攣的臨床研究[J].中醫(yī)臨床研究，2013,5(4):7-9.

[3] 黃慶勇，李煌，許文，等.君藥天花粉對復方栝樓桂枝湯中9種成分的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(12):57-60.

[4] 王孝平,邢樹禮.考馬斯亮藍法測定蛋白含量的研究[J].天津化工,2009,23(3)：40-41．

(責任編輯：魏 曉)

2015-04-13

福建省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1035-14)；福建省科技計劃重點項目(2013Y0047)；福建省教育廳項目(JB13090)；福建中醫(yī)藥大學校管科研課題(XB2013037)

張繼州(1989-)，男，福建省中醫(yī)藥研究院研究實習員，研究方向為中藥藥理。

胡娟(1962-)，女，福建中醫(yī)藥大學教授，研究方向為中藥藥效物質基礎。E-mail：huj@fjtcm.edu.cn

R284.2

A

1673-2197(2015)17-0020-01

10.11954/ytctyy.201517010