朱 秋

(駐馬店市第一中醫(yī)院，河南 駐馬店 46300)

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冬蟲夏草中主要核苷類成分測定

朱 秋

(駐馬店市第一中醫(yī)院，河南 駐馬店 46300)

目的：通過使用靈敏、可靠的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合同時進(jìn)行分離和電噴霧電離質(zhì)譜的方法(LC/ESI-MS)檢測冬蟲夏草中胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷和蟲草素。開發(fā)新的檢測冬蟲夏草中主要核苷類成分的方法。方法：使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合同時進(jìn)行分離和電噴霧電離質(zhì)譜的方法(LC/ESI-MS)，檢測冬蟲夏草中胸腺嘧啶，腺嘌呤，腺苷和蟲草素。結(jié)果：該方法成功用于同時檢測冬蟲夏草中核苷的成分。結(jié)論：LC/ESI-MS方法在中藥活性成分的分析是一種非常有效的技術(shù)。

冬蟲夏草；核苷類；LC/ESI-MS

冬蟲夏草在我國傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)主要用于治療高血糖癥，呼吸疾病和肝臟疾病，及腎功能不全、腎功能衰竭等[1]。核苷是冬蟲夏草中非常重要的質(zhì)量控制指標(biāo)[2]。目前有幾種技術(shù)可用于冬蟲夏草中主要核苷的分析，如薄層色譜法(TLC)[3]、高效液相色譜(HPLC)[4]和毛細(xì)管電泳[5]。然而，這些方法通常可確定只有一個或兩個相對含量較高的核苷，而對于一些相對微量的核苷檢測并不是特別靈敏，但是這些微量核苷也是冬蟲夏草質(zhì)量重要判定指標(biāo)。本研究開發(fā)了一個簡單和可靠的液相色譜(LC)-mass光譜檢測器(MS)聯(lián)合電噴霧離子化(ESI)方法，同時進(jìn)行分離和測定該類核苷。

1 儀器

質(zhì)譜儀LCMS-2010，液相色譜系統(tǒng)，VP-ODS(2.0mm×150mm)(島津，京都，日本)，DGU-14A脫氣機(jī)。C18Guard-pak cartridge(沃特斯，米爾福德，MA，USA)。通過資料和驗(yàn)證，設(shè)定[M+H]+ions 的m/z值在127，136，268，252和302。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取各標(biāo)樣10mg，分別置于10mL量瓶中，用25%甲醇精確定容。精密稱取各待測樣本0.1g，置于10mL試管中，分別使用回流法、研磨和超聲法提取，取5mL上清液，再用25%甲醇定容至刻度。

2.2 色譜條件優(yōu)化

在使用LC/ESI-MS法時，流動相的選擇應(yīng)考慮分析物分離后并產(chǎn)生電離的影響。對于核苷從蟲草和其類似物中的分離，一些報(bào)道已經(jīng)指出使用梯度洗脫的流動相，包括KH2PO4緩沖液和甲醇，但由于低揮發(fā)性和高鹽濃度，這種溶劑系統(tǒng)不適合于LC/ESI-MS分析。因此，醋酸銨被選擇用于控制移動相的酸度。用乙酸銨和甲醇作為流動相和梯度洗脫程序，使得四個主要核苷可成功被分開。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

每組七個非零點(diǎn)校準(zhǔn)樣，1.0～117.5μg/mL為胸腺嘧啶，1.8～127.0μg/mL為腺嘌呤，0.6～114.0μg/mL為腺苷和0.5～107.5μg/mL為蟲草素作為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。校準(zhǔn)曲線是通過繪制每種分析物的峰面積比(Y)的計(jì)算，并在LC/ESI-MS對濃度(X,μg/mL)每個標(biāo)準(zhǔn)物一式三份進(jìn)行分析，濃度為10μg/mL。

表1 主要核苷類類線性方程

2.4 線性關(guān)系考察

通過以上的方程，得知由于胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素都存在于冬蟲夏草提取物，事實(shí)上并不存在所謂的真正的空白對照。因此使用溶劑作為空白對照進(jìn)行了分析，結(jié)果證明在m/z為127、136、268、252和302數(shù)值下沒有檢測到任何峰值，因此，在各個樣本加入濃度分別為2、20、100μg/mL時，胸腺嘧啶測出值分別為：2.06、19.7、101.6；腺嘌呤測出值分別為：1.96、20.7、99.3；腺苷測出值分別為：1.96、20.3、99.6；蟲草素測出值分別為：2.08、20.04、99.3。通過以上結(jié)果得知，相關(guān)性R在0.998 9～0.999 1之間，說明了不同濃度的分析數(shù)據(jù)保持了非常良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

通過6次重復(fù)進(jìn)樣測試，計(jì)算各個峰值的面積RSD值分別為0.64%、0.51%、0.27%和0.47%，與同類型的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)結(jié)果基本一致，表明該方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性測試

在0、2、4、6、8、12、24h時間點(diǎn)進(jìn)樣測定各組分的含量，結(jié)果表明以上各個時間點(diǎn)的樣本在數(shù)據(jù)上無明顯差異，表明RSD的值分別為1.04%、2.00%、1.75%和1.42%，驗(yàn)證了有效成分在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 樣品回收率測試

取以上樣本，每份約10mg，加入胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素的標(biāo)準(zhǔn)樣本混合溶液5mL，各有效成分的回收率分別如下：胸腺嘧啶為99.40%，腺嘌呤為98.98%，腺苷為99.27%，蟲草素為98.20%，結(jié)果可靠、穩(wěn)定。

3 討論

冬蟲夏草由于產(chǎn)量有限，需求量高，因此目前市場上存在大量的假冒偽劣產(chǎn)品，并且常規(guī)方法很難辨別，而一般的測定方法，均有其局限性，如常規(guī)的HPLC、凝膠電泳法等只能測定其中一到兩種主要核苷，而對于相對微量的核苷則不敏感[1-3]。由于常規(guī)的冬蟲夏草定量分析需要0.3～0.6g樣本，單株的冬蟲夏草一般很難達(dá)到要求，而本研究中，冬蟲夏草的用量可以控制在0.1g以內(nèi)，大大減少了材料的需求，同時也能夠達(dá)到單株間比較的目的?？紤]到核苷是水溶性的，因此在提取時不能使用常規(guī)的方法進(jìn)行提取，本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為溶劑，同時，甲醇濃度的梯度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了25%的濃度得率最高。

另外，在樣本的初步提取方面，比較了三種不同的方法，包括細(xì)胞研磨、回流提取和超聲破碎，由于蟲草與其他孢子類菌不同，子坐和蟲體都比較難研磨，因此選擇回流提取。通過使用梯度洗脫系統(tǒng)和2-氯腺苷為內(nèi)參，找到了適合的LC/ESI-MS的方法來檢測冬蟲夏草中的四個主要核苷，方法包括分離和測定，并且通過了最終的驗(yàn)證。目前在蟲草的成分分析上，HPLC和凝膠電泳是比較常規(guī)的檢測方法，但是單純使用一種分析方法往往只能檢測到其中的幾種核苷成分，本研究通過儀器上的聯(lián)用和方法學(xué)上的改進(jìn)，新的模型可用于快速準(zhǔn)確地鑒定蟲草材料中核苷的含量差異，尤其是通過儀器的聯(lián)用，達(dá)到了對多個不同屬性以及較難檢測核苷的檢測。而在常規(guī)方法的檢測中，常常會遇到檢測不到鳥嘌呤、胸腺嘧啶和蟲草素等情況。使用LC/ESI-MS聯(lián)用的手段解決了以上的難題，由于可以檢測多種不同的核苷，這也幫助我們發(fā)現(xiàn)了來源、產(chǎn)地、儲存時間和條件等不同，樣本中的核苷含量也有所不同，為以后進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。因此，本研究結(jié)果表明，使用LC/ESI-MS方法在中藥活性成分的分析中是一種非常有效的技術(shù)。

[1] 梁洪卉，程舟，楊曉伶，等. HPLC定量分析冬蟲夏草的主要核苷類有效成分[J].中藥材，2008，31(1)：25.

[2] 李紹平，李萍.季暉，等.毛細(xì)管電泳法測定冬蟲夏草中核苷類的含量[J].藥物分析雜志，2001，21(2)：71.

[3] 陳作紅，田向榮，孟祥賢，等.古尼蟲草核苷類成分的高效液相色譜分析[J].菌物系統(tǒng)，2003,22(3):489-493.

[4] 丁婷，胡豐林，耿德貴，等.冬蟲夏草及其無性型菌株發(fā)酵液中核苷類成分的HPLC法定量分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(6):97-99.

[5] 錢正明，周妙霞，孫敏甜，等.冬蟲夏草不同部位核苷類成分比較分析[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2014(11)：58.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

2015-04-30

朱秋(1972-)，男，河南省駐馬店市第一中醫(yī)院主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴庤b別及制劑深加工。

R284

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1673-2197(2015)17-0028-02

10.11954/ytctyy.201517014