彭海博，吳 霞，張 宇，馮毅凡

(廣東藥學院 中心實驗室，廣東 廣州 510000)

?

超高效液相串聯質譜快速定性分析大薊

彭海博，吳 霞，張 宇，馮毅凡*

(廣東藥學院 中心實驗室，廣東 廣州 510000)

大薊是治療高血壓、各種出血和炎癥的一種中藥，但目前鮮有關于其有效成分的報道。通過UPLC/Q-TOF建立一種快速高效的方法對大薊所含成分進行分析。基于精確分子量、計算分子成分，結合二級質譜數據及相關文獻報道，發(fā)現并確定29種成分結構，包括黃酮、黃酮糖苷、異黃酮、有機酸和蒽醌類化合物。其中斑鳩菊酸、叔丁基羥基茴香醚、二氫辣椒素、大黃蒽醌和紫杉葉素等為首次在大薊中發(fā)現并討論其ESI源中的二級質譜裂解規(guī)律，黃酮在ESI源中脫去CO和H2O的二級裂解規(guī)律也初次被闡述。

大薊；二級質譜碎片；超高效液相-Q-TOF-MS；快速分析

大薊是一種多年生草本植物，廣泛分布于中國、日本和朝鮮。在傳統(tǒng)中藥中，大薊因具有抗出血和利尿的作用而被廣泛應用于外傷性出血、高血壓和炎癥的治療[1]。劉素君等[2-4]研究發(fā)現大薊具有抗腫瘤、抗氧化等作用，同時對糖尿病有一定治療作用。

超高效液相串聯Q-TOF技術(UPLC/Q-TOF-MS)是一種快速、靈敏、精確的非靶向分析方法，通過精確分子量和二級質譜裂解確定分子式和分子結構。相比于傳統(tǒng)分析方法，如高效液相串聯低分辨率質譜，UPLC/Q-TOF-MS具有更好的分離效果和更高的分辨率。因此，其更適用于中藥中未知成分的快速分析和結構鑒定。近十年內，大薊中已被鑒定的成分有33種，大薊甲醇提取物成分的快速分析研究尚未見報道。因此，有必要建立一種從大薊提取液中直接進行成分分析的快速方法。

本研究建立了UPLC/Q-TOF法快速簡便分析大薊中的成分，共鑒定出29種成分。其中一些二級裂解規(guī)律為第一次在ESI源中被報道，首次在大薊甲醇提取液中發(fā)現的是斑鳩菊酸、叔丁基羥基茴香醚、二氫辣椒素、大黃蒽醌和紫杉葉素。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈(色譜純)和甲醇(色譜純)均購自Merck公司(德國，達姆施塔特)。甲酸(色譜純)購自DIMA(美國，弗吉尼亞州)。亮氨酸-腦啡肽購自Sigma公司(美國，密蘇里州)，大薊購自廣州至信藥材公司，全草經過廣東藥學院劉基柱教授鑒定保存于本實驗室，編號：2001304081017。

1.2 樣品制備

取大薊全草1.0g切碎，加入甲醇-水(1∶1)10mL 60℃下水浴1h，超聲提取2次，每次1h。提取液經10 000rpm高速離心2min，微孔濾膜(0.22μm)過濾，進樣量為5μL。

1.3 色譜條件

超高效液相為Waters公司Acquity系統(tǒng)，配置2元泵，真空脫氣并自動進樣。色譜柱為Waters公司BRH分析柱(50mm×2.1mm，1.7μm)，流速為0.3mL/min，柱溫為25℃，流動相為為乙腈(B)-0.1%甲酸水(A)[5]。梯度洗脫：0～4min，5%～20% B；4～10min，20%～30% B；10～11min，30%～45% B；11～16min，45%～65% B；16～17min，65%～100% B。

1.4 質譜條件

毛細管電壓為3 000V，錐孔電壓為30V，源溫為100℃，脫溶劑溫度為350℃，錐孔氣流為50L/h，脫溶劑氣體為600L/h，碰撞氣體為氬氣，碰撞能量為25～45V，質譜數據采集范圍為m/z 50～1 000，采用亮氨酸-腦啡肽作為參考標準溶液(正離子模式下[M+H]+=556.2771，[M+H]-=554.2615)。

2 結果

2.1 UPLC/Q-TOF分析條件優(yōu)化

通過預實驗，將UPLC最佳流速設定為0.3mL/min[6]。通過對甲醇-水、乙腈-水、乙腈-異丙醇流動相體系進行考察，同時考慮保留時間、加和離子和分離效果等因素，最終選擇乙腈-水(含0.1%乙酸)體系進行梯度洗脫。由于不同離子模式對離子對有競爭性抑制作用，實驗結果顯示負離子模式靈敏度和信噪比均較高。

2.2 UPLC/O-TOF分析

本次實驗中共有29個成分被鑒定出來(見表1、表2)，包括黃酮、黃酮糖苷、異黃酮、有機酸、酚酸和蒽醌類化合物。本研究中鑒定的成分已經通過Sci-finder數據庫確認。

2.2.1 黃酮和黃酮糖苷裂解 黃酮類在一級質譜中只有母離子存在，無法鑒定其分子結構，但黃酮類的二級質譜行為可確定B環(huán)和C環(huán)上的羥基數量和位置。因此，將黃酮類的一級質譜與二級質譜相結合可準確鑒定出其分子結構。

本實驗中，毛地黃酮在負離子模式下產生了m/z 199的特征峰，可能是由于A環(huán)和B環(huán)的作用，導致C2H2O和CO2基團連續(xù)脫去[7]。負離子模式下C環(huán)脫去一個O原子，但是該現象并未在芹黃素和槲皮素中發(fā)現，可能是由于3-位沒有羥基取代，也可能是B環(huán)上羥基的供電子作用破壞了環(huán)上的共軛結構，從而降低了C環(huán)的穩(wěn)定性，導致m/z 269特征碎片離子的產生。在正離子模式下產生了m/z 241的特征峰，是由于C環(huán)脫去CO2，B環(huán)脫去一分子H2O[8]。此外，由于1，3B+裂解容易脫去1分子H2O，所以 1，3B+會產生m/z 117的碎片離子。

芹黃素的特征碎片是m/z 153和119。 C環(huán)由于失去一個CO基團而緊縮，產生了m/z 243的碎片。m/z 243的碎片可進一步裂解失去CO和H2O，產生新的碎片m/z 197。特征碎片m/z 153可通過脫去一分子H2O而產生新的特征碎片m/z 171。

槲皮素由于在3-位上有羥基取代，1，3A+和1，2A+都會產生特征例子m/z 179。1，2A+容易脫去CO基團，故m/z 151是槲皮素的主要碎片診斷離子。同時，異黃酮類相對于黃酮類需要更高的碰撞能量才能得到特征碎片離子[9]。

B環(huán)上的羥基取代程度可影響黃酮糖苷的質譜裂解行為。B環(huán)上羥基越多，在低能量撞擊下脫去糖苷鍵碎片的強度越高。毛地黃酮-7-O葡萄糖苷在B環(huán)上有一個羥基取代，比蒙花苷-7-O蕓香糖苷和芹黃素-7-O吡喃糖苷產生的脫糖苷碎片豐度更高。此外，糖苷鍵的取代位置對碎片也有影響，槲皮素-3-O蕓香糖苷在B環(huán)上有兩個羥基取代，但是相比于毛地黃酮-7-O葡萄糖苷則需要更高的碰撞能量才能得到黃酮碎片離子。羥基和O-糖苷鍵是供電子基團，由于定位效應和共軛效應，B環(huán)上未被取代和3-位上有供電子基團的結構需要更高的碰撞能量。因此，當毛細管電壓和錐孔電壓分別設定在3 000V和30V時，槲皮素-3-O蕓香糖苷的槲皮素殘基可在一級質譜中被找到[10]

2.2.2 新分離成分結構特征 首次在大薊甲醇提取液中發(fā)現的是斑鳩菊酸、叔丁基羥基茴香醚、二氫辣椒素、大黃蒽醌和紫杉葉素。由于存在離子對競爭性抑制，大黃素-甲醚、二氫辣椒素、叔丁基茴香基醚僅存在于正離子模式下，斑鳩菊酸、半夏酸、紫杉葉素僅存在于負離子模式下。

大黃素-甲醚的主要碎片離子為脫落了一個甲基基團的m/z 270，其結構是通過共軛作用保持穩(wěn)定性的。此外，由于3-位CO基團的脫落，產生了m/z 242的碎片離子[11]。

二氫辣椒素的主要碎片離子m/z 290與文獻報道的主要碎片離子m/z 137并不一致[12]，碎片離子m/z 136進一步失去一個CH2基團，碎裂成為m/z 122的碎片離子，這個裂解是ESI源中沒有發(fā)現過的。二氫辣椒素的主要裂解途徑是通過N-C鍵的斷裂，其主要碎片離子(m/z 137)也是由于N-C鍵斷裂而產生的[12-13]，可能的機制見圖1。

圖1 正離子模式下二氫辣椒素裂解途徑

峰號保留時間電離模式質荷比(m/z)計算值(m/z)濃度(ppm)分子式MS/MS(m/z)分子名稱14.50[M+H]+463.0880463.08770.6C21H18O12287,153,135Luteolin7-O-glucuronide25.24[M+H]+447.0929447.09270.4C21H19O11271,153,1194H-1-Benzopyran-4-one,3-(β-D-glucopyranosyloxy)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-35.68[M+H]+275.0923311.0933275.0925311.0919-0.74.5C15H14O5C18H14O5257,239,183,171,143,128147,166,178,187,190,233,266epi-Afzelechin6-Desoxyjacareubin47.20[M+H]+287.0557287.0556-0.3C15H10O6241,153,135,117Luteolin57.35[M+H]+593.1823593.1870-7.9C28H32O14285Linarin-7-O-rutinoside68.72[M+H]+308.2230308.22261.3C18H29N1O3290,262,206,192,179,136,122Dihydrocapsaicin78.86[M+H]+271.0609271.06061.1C15H10O5243,225,171,153,119Apigenin810.02[M+H]+181.1206181.122912.7C11H16O2137,105ButylatedHydroxyanisole911.19[M+H]+259.0975259.09701.9C15H14O4243,225,211,143,131O-Desmethylangolensin1011.88[M+H]+403.2070403.20802.5C18H30N2O8224,152,117,105Tyrosine1112.03[M+H]+285.0768285.07631.8C16H12O5270,242,153,133Physcion

表2 負離子模式下成分鑒定

叔丁基茴香基醚的質譜信息可通過Wiley數據庫進行鑒定，m/z 137是其主要的碎片離子，但仍可以進一步失去一個CH4O基團，碎裂為m/z 105形成另一個主要碎片離子。

斑鳩菊酸是第一次在ESI-MS中被報道，其主要碎片為m/z 277(M-H2O-H-)和m/z 195 (M-C6H12O-H-)。半夏酸的裂解方式和斑鳩菊酸類似。

紫杉葉素的母離子相繼脫去一個二苯基基團和一個C3O3H5基團，產生了m/z 241和m/z 151碎片離子。

3 結論

應用UPLC/Q-TOF-MS 技術對大薊甲醇-水提取物進行快速分析，在17min內成功鑒定出29種成分，其中5種化學成分為首次在大薊中發(fā)現。本文闡明了電噴霧質譜中大薊各成分的裂解規(guī)律，并總結了大薊中各類成分的主要碎片離子和異黃酮類中[1，2A+-CO+H]+可作為3-位上是否有羥基取代的診斷離子。綜上所述，UPLC/Q-TOF-MS技術可應用于大薊成分的快速分析和結構鑒定。

[1] GANZERA M.Differentiation of Cirsium japonicum and C. setosum by TLC and HPLC-MS[J]. Phytochemical Analysis,2005(16):205-209.

[2] Ni N X. HPLC Studies on Fingerprints of Cirsium japonicun DC. and Cephalano possegetum (Bge) Kitam[J]. Chin J Pharm Anal, 2007,27(6):929-932.

[3] ZHANG T T. HPLC Analysis of Flavonoids from the Aerial Parts of Species[J]. Chinese Journal of Natural Medicines,2010,8(2):107-113.

[4] CUYCKENS.Mass spectrometry in the structural analysis of flavonoids[J]. Journal of Mass Spectrometry,2004,39(1):1-15.

[5] HUA HE.In modern chromatographic analysi[M].Chemical Industry Publisher，2004.

[6] QUETIN LECLERCQ.Determination of Flavone, Flavonol, and Flavanone Aglycones by Negative Ion Liquid Chromatography Electrospray Ion Trap Mass Spectrometry[J].American Society for Mass Spectrometry, 2001(12):707-715.

[7] WOLFENDER J L.Evaluation of Q-TOF-MS/MS and multiple stage IT-MSn for the dereplication of flavonoids and related compounds in crude plant extracts[J].Analusis, 2000,28(10):895-906.

[8] JEAN LUC WOLFENDER. Mass Spectrometry of Underivatized Naturally Occurring Glycosides[J]. Phytochemical Analysis,1992(3):193-214.

[9] HVATTUM. Study of the collision-induced radical cleavage of flavonoid glycosides using negative electrospray ionization tandem quadrupole mass spectrometry[J].Journal of Mass Spectrometry, 2003,38(1): 43-49.

[10] MA XIAOHONG.The electrospray ionization- mass spectra of Radix et rhizoma rhei[J]. Journal of Hubei University( Natural Science), 2006,28(4):105-110.

[11] Zhang Q.Simultaneous quantification of capsaicin and dihydrocapsaicin in rat plasma using HPLC coupled with tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B,2010,878(24):2292-2297.

[12] ROBERT Q THOMPSON.Quantitative determination of capsaicinoids by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry[J]. Anal Bioanal Chem,2005(381):1441-1451.

A Rapid Ultraperformance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometric Method for Qualitative Analysis of Cirsium japonicum

Peng Haibo, Wu Xia, Zhang Yu, Feng Yifan*

(Central Lab of Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510000,China)

Cirsium japonicum is a perennial medicinal plant. A better understanding of this herb requires the detection of new potentially useful compounds and analysis of their application. A rapid and sensitive method for identification of the constituents of C. japonicum was developed, which employed ultraperformance liquid chromatography coupled with electrospray ionization-tandem quadrupole high resolution time-of-flight mass spectrometry (UPLC/Q-TOF-MS). Using this approach, 29 compounds were identified and tentatively characterized, in a period of 17min. These compounds included flavonoids, flavone glycosides, isoflavonoids, organic acids, phenolic acids, and anthraquinones. Among them, vernolic acid, butylated hydroxyanisole, physcion, and taxifolin have been reported for C. japonicum for the first time, and their fragmentation behavior upon electrospray ionization has been discussed. Unusual H2O and CO loss in flavonoids was characterized here for the first time and a new diagnostic ion and new fragmentation pattern were proposed for dihydrocapsaicin. The results indicated that UPLC/Q-TOF-MS was a powerful complementary tool for structural characterization by ESI-MS/MS.

Cirsium japonicum; Fragment; UPLC/Q-TOF-MS; Rapid Identification

2014-09-09

國家自然科學基金項目(1035102201000000)；教育部廣東工業(yè)大學合作研究項目(2009B090300349，2011B090400379)

彭海博(1990-)，男，廣東藥學院碩士研究生，研究方向為中藥質量控制。

馮毅凡，廣東藥學院教授，研究方向為藥物分析。E-mail：tfengyf@163.com.

R284.1

A

1673-2197(2015)02-0016-03

10.11954/ytctyy.201502007