朱 娜，李見(jiàn)春，張文靜，王 秀

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，安徽 蚌埠 233030)

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徐長(zhǎng)卿藥材中丹皮酚超聲提取工藝研究

朱 娜，李見(jiàn)春*，張文靜，王 秀

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，安徽 蚌埠 233030)

目的：篩選超聲提取徐長(zhǎng)卿藥材中丹皮酚的最佳工藝。方法：應(yīng)用超聲提取法，采用L9(34)正交試驗(yàn)，以丹皮酚含量為指標(biāo)，考察料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間3個(gè)因素對(duì)提取工藝的影響，采用HPLC法測(cè)定丹皮酚含量。結(jié)果：丹皮酚的最佳提取工藝為超聲溫度50℃，超聲時(shí)間20min，料液比1∶10。結(jié)論：優(yōu)選的最佳提取工藝穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，可最大限度地提取徐長(zhǎng)卿藥材中的有效成分。

丹皮酚；超聲提??；正交試驗(yàn)；HPLC

徐長(zhǎng)卿為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為蘿摩科植物徐長(zhǎng)卿的根及根莖或帶根全草。其性溫、味辛，歸肝、胃經(jīng)，具有祛風(fēng)化濕、止痛止癢、解毒消腫之功效，臨床廣泛用于濕疹、蕁麻疹、接觸性皮炎等皮膚科疾病及各類(lèi)疼痛、跌打損傷等癥的治療[1]。丹皮酚是徐長(zhǎng)卿的主要活性成分。大量研究表明，丹皮酚具有顯著的抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)作用，對(duì)脾臟、胸腺等免疫器官及淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫分子均具有顯著的調(diào)節(jié)作用。此外，丹皮酚還可抑制組胺、5-羥色胺、緩激肽及花生四烯酸等炎癥介質(zhì)的釋放，對(duì)豚鼠皮膚血管炎性反應(yīng)、大鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)等均具有顯著的抑制作用[2-3]。王玫等[4]采用RT-PCR法考察丹皮酚的抗皮膚炎癥作用，為其作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

隨著丹皮酚研究的日益深入，其提取工藝受到越來(lái)越多的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)在大量查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用超聲提取[5]-水蒸氣蒸餾法[6]提取丹皮酚，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)丹皮酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并建立了一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的高效液相色譜法測(cè)定徐長(zhǎng)卿藥材中的丹皮酚含量，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該活性成分提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LC-20AD二元高壓梯度高效液相，SPD-15C紫外檢測(cè)器，DT-230A柱溫箱(日本島津公司)；FC204型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Milli-Q Advantage A10純水機(jī)(密理博(上海)貿(mào)易有限公司)；XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠)；TG16-W微量高速臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)。

1.2 試劑

徐長(zhǎng)卿為山東產(chǎn)中藥材，經(jīng)鑒定為蘿摩科植物徐長(zhǎng)卿的干燥根和根莖；丹皮酚原料藥(購(gòu)于武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)：20130327，供含量測(cè)定用，純度為99.2%)；甲醇為色譜純，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18Column(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇∶水=75∶25，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為274nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL。在上述色譜條件下，丹皮酚與其他組分可達(dá)到基線分離，溶劑無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取丹皮酚對(duì)照品2.8mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為111μg/mL的丹皮酚對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 供試品溶液制備

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，最終確定供試品溶液制備方法為取徐長(zhǎng)卿粗粉約0.5g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，搖勻，稱(chēng)定重量，超聲處理30min后，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液1mL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性關(guān)系考察

精密量取儲(chǔ)備液適量，用甲醇定容成丹皮酚系列對(duì)照品溶液，濃度分別為0.054、0.217、0.434、1.74、3.47、13.89、27.78μg/mL。分別精密吸取上述系列溶液20μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖和峰面積積分。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分為縱坐標(biāo)，得回歸方程為Y=82 654X-367.47，R2=0.999 9，丹皮酚在0.054～27.78μg/mL濃度范圍內(nèi)與其峰面積積分呈良好的線性關(guān)系。

圖1 徐長(zhǎng)卿中丹皮酚HPLC色譜

2.5 精密度試驗(yàn)

取1.75μg/mL 丹皮酚對(duì)照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算得丹皮酚峰面積RSD為1.3%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別于0、2、4、8、12h精密吸取常溫放置的同一供試品溶液20μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積積分，結(jié)果表明丹皮酚峰面積RSD為1.59%，供試品溶液在常溫下放置12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知丹皮酚含量的徐長(zhǎng)卿供試品9份，分為3組，每組3份。3組樣品分別精密加入低、中、高已知含量的丹皮酚對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，每份樣品重復(fù)3次，記錄峰面積，并計(jì)算平均回收率，得平均回收率為98.18 %，RSD 為1.85%。

2.8 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

稱(chēng)取徐長(zhǎng)卿粗粉40g，置于圓底燒瓶中，水浴40℃，浸泡2h，進(jìn)行超聲提取，水蒸氣蒸餾。根據(jù)單因素試驗(yàn)及超聲清洗器的功能范圍，本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇為固定提取溶劑，以超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比為考察指標(biāo)，按照L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

由上述各表結(jié)果可知，以丹皮酚含量為指標(biāo)，A、B、C因素對(duì)超聲-水蒸氣蒸餾提取結(jié)果影響大小依次為B>A>C，即超聲提取溫度為最主要影響因素，其他因素對(duì)提取結(jié)果有些許影響。綜上可知，最佳提取工藝條件為A3B2C1，即料液比為1∶10，超聲溫度為50℃，超聲時(shí)間為20min。

表1 因素水平

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 正交試驗(yàn)方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00

3 討論

本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[7-8]，選用甲醇為提取溶劑，通過(guò)正交試驗(yàn)得出A3B2C1為最佳方案。方差分析表明B因素對(duì)丹皮酚得率具有極顯著性影響，A因素有顯著性影響，C因素影響不顯著，與文獻(xiàn)中記載丹皮酚超聲提取法的主要影響因素為超聲溫度相符合[9]。結(jié)果顯示最佳超聲時(shí)間為20min，40min時(shí)含量略有下降，原因是時(shí)間過(guò)短，丹皮酚還未充分溶出，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一些熱敏感組分會(huì)被破壞。此外，溶劑揮發(fā)也可能導(dǎo)致丹皮酚含量下降。丹皮酚熔點(diǎn)較低、極易揮發(fā)、水溶性差的理化性質(zhì)也可能導(dǎo)致超聲時(shí)間過(guò)久而對(duì)其結(jié)構(gòu)造成破壞。

丹皮酚是固體針狀結(jié)晶，提取方法較多[10]，其中有機(jī)溶劑浸出法可縮短提取時(shí)間，但引入雜質(zhì)較多；蒸餾-大孔樹(shù)脂法、超臨界CO2流體萃取法對(duì)儀器有特殊要求且成本較高，耗時(shí)較長(zhǎng)。選用超聲提取-水蒸氣蒸餾法可獲得比常規(guī)方法更佳的提取效果。超聲波具有穿透力強(qiáng)、選擇性高、有效成分溶出快速等優(yōu)點(diǎn)，可提高浸出率、縮短提取時(shí)間，同時(shí)可避免高溫對(duì)成分穩(wěn)定性的影響。

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選了徐長(zhǎng)卿藥材中丹皮酚的超聲提取工藝，方法簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好，為其工業(yè)化大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:268.

[2] 馮鑫,鄭洋.徐長(zhǎng)卿抗過(guò)敏功效綜述[J].山西中醫(yī),2006,22(1):45-46.

[3] 孫言才,沈玉先,孫國(guó)平.丹皮酚的主要藥理活性研究進(jìn)展[J].中成藥,2004,26(7):579-582.

[4] 王玫,劉繼勇,韓盈等.丹皮酚對(duì)TNF-α誘導(dǎo)真皮成纖維細(xì)胞MMP-9mRNA及細(xì)胞因子表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2009,25(4):458-461.

[5] 秦梅頌.超聲提取技術(shù)在中藥中的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,16(13):54-56.

[6] 李玉賢,萬(wàn)炎,陳曉嵐.牡丹皮中丹皮酚的提取方法研究[J].河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,22(2):37-38.

[7] 閆晗,劉靜,孫銳,等.高效液相色譜法測(cè)定徐長(zhǎng)卿藥材、丹皮酚注射液及生物樣品中丹皮酚含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2012,8(5):14-16.

[8] 黃麗丹.徐長(zhǎng)卿中丹皮酚含量測(cè)定方法研究[J].安徽醫(yī)藥,2008,12(7):599-600.

[9] 朱琳琳,李玉賢.丹皮酚超聲提取工藝研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào),2011,26(6):713-714.

[10] 王立,侯世祥等.牡丹皮藥材的最適提取工藝研究[J].中國(guó)中藥雜志,2005,30(8):569-571.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

2014-11-19

朱娜(1989-)，女，蚌埠醫(yī)學(xué)院碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬镄聞┬汀?/p>

李見(jiàn)春，男，博士，蚌埠醫(yī)學(xué)院副教授，研究方向?yàn)樗幬镄聞┬?。E-mail：541017959@qq.com

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1673-2197(2015)02-0037-02

10.11954/ytctyy.201502014