郭禮強(qiáng)，宮小明，丁葵英，王 可，孫 軍，趙 晗

(1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 濰坊 261041；2.石家莊市疾病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050011)

基于QuEChERS提取的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定干腌火腿中15種真菌毒素

郭禮強(qiáng)1*，宮小明1，丁葵英1，王 可2，孫 軍1，趙 晗1

(1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 濰坊 261041；2.石家莊市疾病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050011)

建立了干腌火腿中15種真菌毒素(黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、橘青霉素、T-2毒素、HT-2毒素、蛇形菌素、新茄鐮孢菌醇、疣孢青霉原、O-甲基雜色曲霉素、雜色曲霉素、環(huán)匹阿尼酸、青霉酸)多殘留的液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜(QTrap LC-MS/MS)檢測(cè)方法?；鹜葮悠方?jīng)含1%甲酸的乙腈水溶液提取，QuEChERS方法凈化后，以含0.1%甲酸和9.9%乙腈的5 mmol/L乙酸銨水溶液(A)與含0.1%甲酸的乙腈(B)為流動(dòng)相，經(jīng)Eclipse Plus C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)分離，以多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，通過信息相關(guān)掃描方式(IDA)觸發(fā)增強(qiáng)子離子掃描(EPI)，結(jié)合建立的15種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫檢索的多模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，15種真菌毒素在0.05～200 μg/L范圍呈良好線性，相關(guān)系數(shù)均大于0.993，定量下限為0.05～2.5 μg/kg。樣品在1倍、2倍、10倍定量下限3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為79.1%～95.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.2%～12.8%。該方法靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于干腌肉類中真菌毒素的檢測(cè)分析。

干腌火腿；真菌毒素；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；分散固相萃取；QuEChERS

目前，多種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)的方法主要有液相色譜法[7-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-19](LC-MS/MS)。液相色譜法是常用的檢測(cè)方法，但其選擇性較差，多種毒素同時(shí)檢測(cè)受到限制，靈敏度也達(dá)不到要求。LC-MS/MS方法的選擇性好，操作簡(jiǎn)單，省時(shí)，尤其是線性離子阱質(zhì)量分析器，能夠在保證靈敏度的情況下達(dá)到定性化合物的目的。QTrap的優(yōu)勢(shì)是既能得到化合物MRM的信息，也可以設(shè)定MRM域值(IDA設(shè)定)，通過EPI掃描得到化合物二級(jí)質(zhì)譜碎片的全部信息，再結(jié)合譜庫檢索能實(shí)現(xiàn)對(duì)未知化合物的同時(shí)定性定量。本研究選擇易污染干腌火腿的常見產(chǎn)毒真菌代謝物為研究對(duì)象，建立了15種真菌毒素的LC-MS/MS譜庫，并采用QuEChERS前處理提取方法，結(jié)合譜庫檢索建立了干腌火腿中15種真菌毒素的快速LC-MS/MS測(cè)定方法。該方法簡(jiǎn)便快速，可操作性強(qiáng)，只需一步提取濃縮即可同時(shí)定性定量分析干腌火腿中的多種真菌毒素，對(duì)企業(yè)及食品安全監(jiān)管部門提供了有效的技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀：AB eksigent ultra LC 100-XL/Qtrap 5500(美國AB公司)，配電噴霧離子源(ESI)；5810R型離心機(jī)(Eppendorf公司)；N-EVAP氮吹儀(Organomation Associates公司)；Milli-Q純水機(jī)(美國Millipore公司)；KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、赭曲霉毒素A(OTA)、橘青霉素(Citrinin)、T-2毒素(T-2)、HT-2毒素(HT-2)、蛇形菌素(DSA)、新茄鐮孢菌醇(NEO)、疣孢青霉原(Verruculogen)均購于Biopure公司。O-甲基雜色曲霉素(MST)、雜色曲霉素(ST)、環(huán)匹阿尼酸(CPA)、青霉酸(Penicillic acid)購于Sigma公司。中性氧化鋁(Alumina-N)購于上海五四化學(xué)試劑有限公司，石墨炭黑粉(GCB)、C18(ODS)、PSA粉和氨丙基粉(NH2)購于Agela technologies inc公司；甲醇、乙酸乙酯、乙腈和甲酸均為色譜純，購于美國Biopure公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

用乙腈配制真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度100 mg/L) 各50 mL，存儲(chǔ)期6個(gè)月；然后用乙腈配制濃度分別為100 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品中間液，再根據(jù)需要用干腌火腿提取液稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃保存，有效期3個(gè)月。

1.2 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相A：水-乙腈-甲酸(900∶99∶1)+5 mmol/L乙酸銨；流動(dòng)相B：乙腈-甲酸(999∶1)；梯度洗脫程序：0～3.0 min，5%～50% B；3.0～5.0 min，50%～90% B；5.0～8.0 min，90% B；8.0～8.1 min，90%～5% B；8.1～12 min，5% B；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

MRM掃描模式，電離源：ESI+；氣簾氣流量：35 L/min；離子電壓：5 500 V；碰撞氣：氮?dú)?；干燥氣溫度?50 ℃；GS1：55 L/min，GS2：55 L/min；Q1分辨率為low，Q3分辨率為unit；15種真菌毒素的部分質(zhì)譜參數(shù)見表1。當(dāng)MRM信號(hào)域值大于IDA設(shè)定的5 000 cps時(shí)同時(shí)啟動(dòng)EPI功能。EPI掃描范圍：80～750 Da；掃描速率：10 000 Da/s；離子源碰撞氣流速為high；建庫時(shí)碰撞能量(Collision energy，CE)為35，化合物子離子的碰撞能量(Collision energy spread，CES)設(shè)為15。

表1 15種真菌毒素的部分質(zhì)譜參數(shù)

*quantitative ion

1.4 譜庫建立

對(duì)15種真菌毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行EPI掃描，CES為15 V，在20，35，50 V 3種碰撞能量下各采集1張EPI譜圖，平均后得到1張綜合EPI譜圖，將各真菌毒素的EPI譜圖輸入數(shù)據(jù)庫，同時(shí)填寫分子式、相對(duì)分子量及化學(xué)名稱等。

1.5 樣品處理

準(zhǔn)確稱取(4±0.01) g絞碎均勻的干腌火腿樣品，置于50 mL具塞離心管內(nèi)，加入20 mL乙腈-水-甲酸(79∶20∶1，下同)溶液均質(zhì)30 s，超聲輔助萃取90 min，以10 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液10 mL至20 mL干凈玻璃試管中，加入700 mg ODS渦旋振蕩2 min，靜置分層后，取5 mL上清液于干凈10 mL玻璃試管中氮?dú)獯蹈?，? mL含0.1%甲酸的5%乙腈水溶液溶解，于渦旋振蕩器振蕩1 min，經(jīng)0.22 μm雙系濾膜過濾，供QTrap LC-MS/MS分析測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的選擇

提取溶劑對(duì)回收率的影響很大，常用的提取溶劑主要有甲醇-水[7-8,11,14]和乙腈-水[13,15-16,18-20]。比較了兩種提取液對(duì)15種真菌毒素回收率的影響，結(jié)果表明使用乙腈-水作為提取液時(shí)15種真菌毒素的回收率在50%～80%之間，各種毒素均比甲醇-水作為提取液的回收率提高了6%以上。進(jìn)一步考察了提取液pH值對(duì)回收率的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)真菌毒素OTA和DSA在堿性和中性水溶液環(huán)境下不穩(wěn)定，空白基質(zhì)的加標(biāo)回收率僅能達(dá)到50%左右，在提取溶液中加入1%甲酸后回收率可提高到80%以上。干腌火腿基質(zhì)復(fù)雜，而常用的免疫親和柱及多功能凈化柱受真菌毒素化學(xué)性質(zhì)的限制，不能同時(shí)凈化多種真菌毒素，并且凈化成本很高。本文使用QuEChERS方法[21-22]，同時(shí)考察了Alumina-N，GCB，ODS，PSA，NH25種凈化粉對(duì)15種真菌毒素的吸附回收率，通過標(biāo)準(zhǔn)品加凈化粉經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)并計(jì)算回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ODS對(duì)15種真菌毒素的吸附影響較小，回收率為93.5%～117.8%。而文獻(xiàn)報(bào)道中常與ODS聯(lián)合使用的PSA和NH2由于對(duì)OTA，CPA和Penicillic acid的吸附非常嚴(yán)重而不能使用，結(jié)果見表2。

表2 經(jīng)ODS，Alumina-N，GCB，PSA，NH2吸附后15種真菌毒素的回收率

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于待測(cè)15種真菌毒素的質(zhì)荷比在171～534之間，化學(xué)性質(zhì)相差較大，要達(dá)到良好分離比較困難，尤其是4種黃曲霉毒素(AFB1，AFB2，AFG1，AFG2)結(jié)構(gòu)類似，且有相近或相同的碎片離子，出峰時(shí)間不合適易造成EPI譜圖干擾，影響譜庫檢索時(shí)對(duì)真菌毒素定性的判斷。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為甲醇-水(各含0.1%甲酸，下同)時(shí)，疣孢青霉原和青霉酸的峰形不好，分離度達(dá)不到要求。參考已有文獻(xiàn)[15]，調(diào)整流動(dòng)相為乙腈-水，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)確定了“1.2”所述流動(dòng)相比例以及梯度洗脫方法，應(yīng)用該方法時(shí)基線平穩(wěn)，各組分能完全分離，真菌毒素的EPI譜圖無干擾且響應(yīng)值高。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將100 μg/L的15種毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液通過自動(dòng)進(jìn)樣泵以7 μL/min直接注入ESI離子源，在找到真菌毒素各自的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+或[M+NH4]+后，分別優(yōu)化其質(zhì)譜參數(shù)，得到碎片離子信息，優(yōu)化的MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1。化合物的EPI掃描譜圖和MS2掃描譜圖類似，可在優(yōu)化真菌毒素質(zhì)譜參數(shù)時(shí)同時(shí)建立其數(shù)據(jù)庫譜圖，也可在MRM掃描檢測(cè)時(shí)建立。為了達(dá)到同時(shí)定性、定量的目的，本研究采用MRM→IDA→EPI→數(shù)據(jù)庫檢索的模式。以MRM觸發(fā)EPI，可以同時(shí)獲得化合物的保留時(shí)間、峰面積以及全面的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息等，由于EPI掃描比MRM掃描響應(yīng)值高100倍以上，從而提高了方法的靈敏度，并可通過EPI譜庫檢測(cè)和二級(jí)結(jié)構(gòu)信息快速確認(rèn)化合物結(jié)構(gòu)。上述質(zhì)譜條件下15種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/L)的總離子流色譜圖、EPI譜圖以及MRM見圖1。

圖1 15種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖、EPI譜圖和MRM圖

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

對(duì)15種真菌毒素質(zhì)量濃度在0.05～200 μg/L之間的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(用空白火腿提取液配制)進(jìn)行測(cè)定，以各化合物峰面積的平均值(Y)對(duì)其質(zhì)量濃度(X，μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.993。在干腌火腿基質(zhì)中添加系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算方法的檢出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算方法的定量下限(LOQ)，結(jié)果得15種真菌毒素的LOD為0.02～0.8 μg/kg，LOQ為0.05～2.5 μg/kg。15種真菌毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量下限見表3。

表3 15種真菌毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限與定量下限(n=6)

2.5 準(zhǔn)確度與精密度

在干腌火腿空白樣品中添加15種真菌毒素1倍、2倍、10倍定量下限3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。以回收率結(jié)果表示方法準(zhǔn)確度，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示方法的精密度，每個(gè)水平平行測(cè)定6個(gè)樣品，測(cè)定結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，15種真菌毒素在3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為79.1%～95.5%，RSD為3.2%～12.8%。

表4 15種真菌毒素在空白樣品中的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

對(duì)超市購買的15份干腌火腿中的真菌毒素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在1份火腿樣品中檢出CPA，通過EPI譜庫檢索，樣品中CPA離子匹配度為70.2(匹配度值從0到100，大于60為可信)，檢測(cè)含量為1.07 μg/kg(n=3)，其EPI比對(duì)結(jié)果見圖2。

圖2 干腌火腿中陽性樣品EPI譜庫檢索結(jié)果

3 結(jié) 論

本文建立了一種基于QuEChERS原理的前處理技術(shù)，結(jié)合超高效液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜快速測(cè)定干腌火腿中15種真菌毒素殘留的方法，通過MRM掃描和EPI譜庫檢索，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)15種真菌毒素的同時(shí)定性、定量分析。該方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足對(duì)干腌火腿中真菌毒素殘留的檢測(cè)要求。

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Determination of 15 Mycotoxins in Dry-cured Hams with QuEChERS-based Extraction and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GUO Li-qiang1*，GONG Xiao-ming1，DING Kui-ying1，WANG Ke2，SUN Jun1，ZHAO Han1

(1.Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang 261041，China；2.Shijiazhuang Center for Disease Control and Prevention，Shijiazhuang 050011，China)

A method was developed for the simultaneous determination and identification of 15 mycotoxin residues in dry-cured hams，including aflatoxin B1，aflatoxin B2，aflatoxin G1，aflatoxin G2，ochratoxin A，citrinin，T-2 toxin，HT-2 toxin，diacetoxyscirpenol，neosolaniol，verruculogen，O-methyl sterigmatocystin，sterigmatocystin，cyclopiazonic acid and penicillic acid，by liquid chromatography-tandem triple-quadrupole linear ion trap mass spectrometry(LC-MS/MS).The dry-cured ham samples were purified by QuEChERS method after extraction with acetonitrile solution containing 1% formic acid，then separated on an Eclipse Plus C18column(3.0 mm×100 mm，1.8 μm) by gradient elution with mobile phases of 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution(containing 0.1% formic acid and 9.9% acetonitrile,A) and acetonitrile(containing 0.1% formic acid,B).A multiple reaction monitoring(MRM) as survey scan and an enhanced product ion(EPI) scan as dependent scan were performed in an information dependent acquisition(IDA) experiment.The identification of compounds was carried out by library search with a newly developed MS/MS library based on EPI spectra in positive mode.The results showed that the calibration curves were linear in the range of 0.05-200 μg/L for 15 mycotoxins with correlation coefficients(r) more than 0.993.The limits of quantitation(LOQs，S/N=10) were in the range of 0.05-2.5 μg/kg.The average recoveries(n=6) of 15 mycotoxins in dry-cured ham samples at three spiked levels(1 times，2 times，10 times of LOQ) ranged from 79.1% to 95.5% with relative standard deviations(RSDs) of 3.2%-12.8%.The method was sensitive，convenient and accurate，and could satisfy the demand for detection of mycotoxin residues in contaminated dry-cured meat.

dry-cured ham; mycotoxins; liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)；dispersive solid phase extraction;QuEChERS

2014-10-22；

2014-11-10

國家質(zhì)檢總局科研基金項(xiàng)目(2013IK177)；濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃(2014RKX094)

10.3969/j.issn.1004-4957.2015.02.003

O657.63；S852.44

A

1004-4957(2015)02-0141-06

*通訊作者：郭禮強(qiáng)，碩士，工程師，研究方向：食品中真菌毒素檢測(cè)，Tel：0536-8862561，E-mail：glq1980@sina.com