羅曼 劉澤灝 李純

摘要：骨髓來(lái)源MPAC是具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，高糖是干擾MAPC細(xì)胞分化趨勢(shì)的重要因素。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)分析高糖對(duì)MAPC細(xì)胞周期的影響。研究顯示，高糖遲滯MAPC細(xì)胞的細(xì)胞周期在Cl/S期。進(jìn)一步研究的結(jié)果提示，高糖可以通過(guò)TGF-β1調(diào)控ERKl/2信號(hào)通路，選擇性上調(diào)P21蛋白表達(dá)，抑制MAPC的細(xì)胞周期進(jìn)程，此時(shí)的MAPC細(xì)胞Oct4高表達(dá)，具有多項(xiàng)分化能力（處于非分化狀態(tài)）。

關(guān)鍵詞：高糖；MAPC細(xì)胞；細(xì)胞周期；TGF-βi；P21；ERKl/2

中圖分類號(hào)：R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2015）03-0229-08

高血糖可以通過(guò)阻斷內(nèi)皮細(xì)胞周期的Gl期影響其增殖[1]高糖抑制骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖與其細(xì)胞周期在s及G2期被抑制密切相關(guān)[2]。細(xì)胞周期調(diào)控涉及多種周期蛋白參與[3]。細(xì)胞周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合形成二聚體復(fù)合物，通過(guò)磷酸化作用表達(dá)CDK活性，其表達(dá)水平可隨細(xì)胞周期發(fā)生變化；相反，CDK抑制因子通過(guò)與CDK結(jié)合抑制其活性，例如屬于CIP/KIP家族的P21CIP/WAF-l和P27KIP-l。P21和P27通過(guò)抑制周期調(diào)控蛋白E-CDK2復(fù)合物的形成及其功能表達(dá)阻抑細(xì)胞周期進(jìn)程[4]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-pi可參與調(diào)控細(xì)胞周期的Gl/S期[7] 。內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞均可產(chǎn)生rGF-βl[5，6]。高糖可以促進(jìn)TGF-β1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，并通過(guò)TGF-β1介導(dǎo)P21及P27抑制內(nèi)皮細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白E-CDK2復(fù)合物形成及其功能表達(dá)，阻抑細(xì)胞周期進(jìn)程[8]。轉(zhuǎn)錄因子Oct4在胚胎干細(xì)胞及其他多能干細(xì)胞中高表達(dá)與維持干細(xì)胞的多向分化功能，自我再生和分化能力密切相關(guān)[9-11]。在大鼠胚胎干細(xì)胞中，Oct4表達(dá)水平可隨細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，在G2期Oct4達(dá)到表達(dá)峰值[12，13]。具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞MAPC在未分化狀態(tài)時(shí)Oct4高表達(dá)，在分化狀態(tài)時(shí)Oct4表達(dá)明顯下調(diào)。在不同細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下MAPC可趨向不同細(xì)胞系分化，例如TGF-pi，VEGF等[14-16]。通過(guò)高糖干預(yù)未分化狀態(tài)的MAPC細(xì)胞，分析其細(xì)胞周期的變化，探討高糖對(duì)未分化狀態(tài)時(shí)MAPC細(xì)胞周期影響的機(jī)制，從細(xì)胞周期層面分析高糖對(duì)MAPC增殖和分化的影響；為MAPC細(xì)胞在糖尿病血管病變損傷修復(fù)中的應(yīng)用提供理論支持。

1材料和方法

1.1材料

MAPC細(xì)胞（俄亥俄州立大學(xué)），DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司，TGF-pl單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司，小牛血清購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PD98059抑制劑，P-ERK、P27、P21，CDK2、P-CDK2以及p-actin均購(gòu)自美國(guó)Cell Sig-nal公司，P21抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，用于QPCR的引物均由美國(guó)Invitrogen公司合成。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MAPC細(xì)胞來(lái)源3或4周大小雌性Fischer大鼠[14-16]。在具有良好分化潛能的MAPC中Oct4陽(yáng)性高表達(dá)（作為其特異性的標(biāo)志之一）。在配制好的非分化細(xì)胞培養(yǎng)基中含有5.5 mmol/L右旋葡萄，以及ITS、LA-BSA、PDGF-BB、EGF、LIF等細(xì)胞因子以促進(jìn)細(xì)胞更新，同時(shí)維持MAPC細(xì)胞的未分化狀態(tài)。MAPC細(xì)胞的高密度培養(yǎng)，將細(xì)胞種植在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)加入分化細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的重要成分與非分化細(xì)胞培養(yǎng)基相同，但去除了PDGF、EGF和LIF這3種細(xì)胞因子。每隔24 h，最多不超過(guò)48 h更換一次分化細(xì)胞培養(yǎng)基。為排除特異性細(xì)胞因子的定向誘導(dǎo)作用，分化培養(yǎng)基中未加入TGF-pl，因此培養(yǎng)基中的TGF-β1均來(lái)源于MAPC細(xì)胞自身。對(duì)MAPC細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，分為高糖組（分化培養(yǎng)基中右旋葡萄糖的終濃度為25.5 mmol/L）；正常組（分化培養(yǎng)基中右旋葡萄糖的終濃度為5.5 mmol/L）；對(duì)照組（分化培養(yǎng)基中加入左旋葡萄糖，左旋葡萄糖+右旋葡萄糖的終濃度為25.5 mmol/L）。

1.2.2細(xì)胞周期分析

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MAPC細(xì)胞周期的變化。MAPC細(xì)胞依照每cm2 200個(gè)細(xì)胞的密度種植在細(xì)胞培養(yǎng)板上，無(wú)血清DMEM同步化處理24 h。分別收集24 h、36 h、48 h以及72 h培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，將其懸浮在4 0C PBS溶液中（含有0.1010葡萄糖），然后迅速加入70%冰乙醇（-20 0C）混勻。混懸細(xì)胞液在1 500 g離心力作用下離心，然后用PBS洗滌。用含有50 μL碘化丙啶（PI）和10 μL RNaseMix （20 mg/mL）的PBS重懸浮，使DNA固定，在37 0C中孵育30 min。通過(guò)FACS Calibur流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，結(jié)果通過(guò)Mod-Fit軟件系統(tǒng)分析得到細(xì)胞周期圖樣結(jié)果。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR分析

利用RNeasy試劑盒（美國(guó)QiaGen Sciences公司）從各干預(yù)組MAPC細(xì)胞中提取總RNA，使用SmartSpec Plus核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度，TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Applied Biosys-tems公司）將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)Roche美國(guó)公司提供的軟件設(shè)計(jì)Q Real-time PCR引物，并在美國(guó)Invitrogen公司合成設(shè)計(jì)好的引物。Mx3000P熒光定量PCR儀自動(dòng)分析并輸出Ct值作為結(jié)果。通過(guò)公式：基因的相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct（△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；△△Ct=△Ct各樣本或各時(shí)間點(diǎn)樣本一△Ct正常樣本或0時(shí)段樣本）計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。各引物序列如下：P21上游5-gacatctcagggccgaaa-3'，下游5'-ggcgcttggagtgatagaaa-3'，P27上游5'-tttga-cttgcat-gaagagaagc -3'，下游5'- agctgtctctgaaagggac-att-3'，Oct4上游5'-ctgtaaccggcgccagaa-3'，下游5' -tg-catggggagagcccaga -3'，GA PDH上、上游：5'-tgggaag -ctggtcatcaac-3，下游5'-gcatcaccccatttgatgtt-3。

1.2.4 Western-blot測(cè)定

從各干預(yù)組MAPC細(xì)胞中提取總蛋白，利用BCA法測(cè)定蛋白濃度，并依據(jù)測(cè)定的濃度在配制的PAGE膠中上樣電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉，然后依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模鱌VDF膜分別孵育在5010脫脂牛奶中，其中加入相應(yīng)的一抗處理，在經(jīng)過(guò)相應(yīng)二抗處理后用ECL工作液顯色并利用高敏膠片（美國(guó)GE公司）在暗室中曝光成像。通過(guò)核酸蛋白分析儀掃描分析后，用美國(guó)NIH提供的ImageJ軟件分析條帶灰度和面積后，通過(guò)內(nèi)參照p-Actin校正，結(jié)果將用于蛋白表達(dá)量的半定量分析。

1.2.5 ELISA分析

待測(cè)樣品（無(wú)論細(xì)胞培養(yǎng)上清或是細(xì)胞漿）需要加入鹽酸激活，再加入氫氧化鈉中和激活的樣品，然后用TGF-pi ELISA試劑盒（美國(guó)R&DSystems公司）處理待測(cè)樣品，利用Victor 3V 1 420多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀，在優(yōu)化的450 nm波長(zhǎng)處讀取吸待測(cè)樣品的光度值，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得公式計(jì)算各樣濃度。

1.2.6免疫熒光分析

將實(shí)驗(yàn)用MAPC細(xì)胞依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆N植在chamber板中，在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)去除細(xì)胞培養(yǎng)基并用多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，加入相對(duì)應(yīng)的一抗處理MAPC細(xì)胞，然后加入一抗相對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記物標(biāo)記的二抗，處理好的細(xì)胞樣本置于NikonEclipse TE 2000-S熒光顯微鏡下觀察，并用Nikon公司提供的軟件分析處理得到的圖像。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以s（標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，數(shù)據(jù)分析采用SigmaStat 2.03統(tǒng)計(jì)分析軟件（美國(guó)Aspiresoftware international公司），統(tǒng)計(jì)分析法為t-test或是單因素方差分析；所有的結(jié)果均來(lái)自3組以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖選擇性阻斷MAPC細(xì)胞周期在G1/S期

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI標(biāo)記的MAPC，在非分化培基中培養(yǎng)36 h后，27.80/0處于Gl期，59.90/0處于S期，12.3 010處于G2期。在加入HG的培基中，細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生明顯改變，68.3 010處于Gl期，19.2%處于S期，12.5 010處于G2期（圖1A）。單純高滲培養(yǎng)，MAPC的細(xì)胞周期進(jìn)程未發(fā)現(xiàn)明顯變化。在分化培基中高密度培養(yǎng)48 h，MAPC的細(xì)胞周期進(jìn)程未受高糖刺激影響（圖1B），與低糖及高滲培養(yǎng)基中無(wú)差異。顯然，高糖刺激主要遲滯處于未分化狀態(tài)的MAPC的細(xì)胞周期進(jìn)程（圖1）。

2.2 高糖對(duì)MAPC細(xì)胞P21和P27表達(dá)的影響

CDK-I（細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子）例如P21和P27，通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白E-CDK2復(fù)合體的形成及其功能調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。通過(guò)Western-blot及Q-PCR檢測(cè)高糖培基中MAPC細(xì)胞P21、P27、CDK2及P—CDK2（磷酸化CDK2）表達(dá)水平。P21 mRNA表達(dá)水平是基礎(chǔ)水平的3倍多（n=3，P<0.05）（圖2A）；P21蛋白表達(dá)水平上調(diào)（圖2C，E）；高滲對(duì)P27在mRNA及蛋白水平均無(wú)影響（圖2A，B）；P27 mRNA及蛋白表達(dá)均未受高糖和高滲影響（圖2A、C）。眾所周知，P21可以參與CDK2復(fù)合物的形成，從而使細(xì)胞周期停止在Gl期。MPAC總CDK2水平雖未受到細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境因素影響，但P-CDK2表達(dá)明顯被高糖抑制（圖2D）。依據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，高糖誘導(dǎo)P21而非P27調(diào)控CDK2表達(dá)抑制MAPC的細(xì)胞周期（圖21。

2.3 高糖作用下MAPC細(xì)胞TGF-β1、TGF-βR2、ERKl/2磷酸化水平和P21與細(xì)胞周期的關(guān)系

在高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，MAPC細(xì)胞TGF-βl mRNA表達(dá)水平上調(diào)，在36 h時(shí)到達(dá)表達(dá)峰值，為Oh時(shí)的20倍以上（圖3 A）。在高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，MAPC細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，在48 h持續(xù)上調(diào)（圖3 B）。高滲培養(yǎng)對(duì)MAPC細(xì)胞TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。進(jìn)一步探討TGF-[3R2特異性受體表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在36 h時(shí)間點(diǎn)，高糖上調(diào)TGF-pR2蛋白表達(dá)水平4倍以上（n=3；P<0.05）（圖3C），P-ERKl/2表達(dá)也明顯上調(diào)（圖3G）；高滲對(duì)TGF-3R2蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響（圖3C）。以上結(jié)果推測(cè)，高糖上調(diào)MAPC細(xì)胞TGF-β1/TGF-βR2表達(dá)調(diào)控激活ERKl/2信號(hào)通路。進(jìn)一步探討在高糖刺激下，MAPC細(xì)胞TGF -β1與P21蛋白表達(dá)及ERKl/2磷酸化之間的關(guān)系。通過(guò)TGF-β抗體（5mg/L）阻斷培養(yǎng)基中的TGF-β作用，TGF-βR2表達(dá)明顯下調(diào)（n=3；P<0.05）（圖3C）。同時(shí)，上調(diào)的P21蛋白在TGF-pl抗體作用下明顯下調(diào)（圖3E），ERKl/2磷酸化水平也明顯下調(diào)（圖3G）。同時(shí)檢測(cè)MAPC細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖刺激對(duì)MAPC細(xì)胞的周期影響消失，與普通培養(yǎng)條件下的類似（圖1）。為進(jìn)一步驗(yàn)證ERKl/2信號(hào)通路是否涉及以上的調(diào)控變化，特異性MEK1抑制劑PD98059被用于減低ERKl/2磷酸化作用。PD98059阻斷ERKl/2激活（圖3F），同時(shí)高糖誘導(dǎo)上調(diào)的P21表達(dá)水平可以被明顯抑制（圖3D），MAPC細(xì)胞周期進(jìn)程被阻斷（圖1）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，高糖刺激阻抑MAPC細(xì)胞周期可以通過(guò)TGF-pi激活ERKl/2信號(hào)通路上調(diào)P21蛋白表達(dá)水平調(diào)控（圖3）。

2.4 高糖對(duì)MAPC細(xì)胞AKT的影響

AKT作為一種重要的細(xì)胞因子參與細(xì)胞周期調(diào)控，因此在該實(shí)驗(yàn)中通過(guò)Western blot分析了MAPC細(xì)胞AKT的激活水平。結(jié)果顯示，高糖對(duì)MAPC細(xì)胞AKT （Ser473）磷酸化水平的影響與低糖及高滲條件下無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示高糖無(wú)法通過(guò)AKT來(lái)調(diào)控MAPC細(xì)胞周期（圖4）。

2.5 高糖對(duì)Oct4表達(dá)的影響

既往研究已證明MAPC細(xì)胞在高糖培基中培養(yǎng)7d，細(xì)胞的增殖及形態(tài)發(fā)生改變。在高糖和普通培養(yǎng)基中的MAPC細(xì)胞Oct4表達(dá)水平在mRNA及蛋白水平無(wú)明顯變化（圖SA、B）。TGF-pi抗體或PD98059抑制劑對(duì)MAPC細(xì)胞Oct4表達(dá)水平無(wú)明顯影響（圖SB）。在分化誘導(dǎo)培基中培養(yǎng)6d后，特異性vWF表達(dá)同時(shí)，Oct4表達(dá)明顯下調(diào)（圖5C），與眾多的研究結(jié)果相同，提示MAPC開始分化。綜合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，高糖對(duì)MAPC細(xì)胞周期的影響，主要在分化前期，在MAPC保持多向分化潛能狀態(tài)時(shí)（圖5）。3討論

細(xì)胞周期包括間期和有絲分裂期，間期又可分為Gl，S和G2期。Gl期是合成前期，此期主要合成RNA和核糖體，意義在于為下階段S期的DNA復(fù)制作好物質(zhì)和能量的準(zhǔn)備；S期即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同時(shí)還要合成組蛋白，DNA復(fù)制所需要的酶都在這一時(shí)期合成。G2期即DNA合成后期，在這一時(shí)期，DNA合成終止。間期是細(xì)胞合成DNA、RNA、蛋白質(zhì)和各種酶的時(shí)期，是為細(xì)胞分裂準(zhǔn)備物質(zhì)基礎(chǔ)的主要階段。Gl期的細(xì)胞可分為增殖細(xì)胞，例如骨髓細(xì)胞；休止細(xì)胞，可能因外在因素導(dǎo)致該細(xì)胞暫時(shí)不過(guò)渡至S期；不增殖細(xì)胞，例如高度分化的神經(jīng)細(xì)胞，這類細(xì)胞將停止在Gl期，最后通過(guò)分化、衰老至死亡。Gl/S期的過(guò)程是重要的細(xì)胞周期調(diào)控階段，受到多種外在因素的干擾，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力發(fā)生改變。造血干細(xì)胞是明確的周期性細(xì)胞，保持連續(xù)進(jìn)入細(xì)胞周期循環(huán)的能力，始終保持活躍的增殖能力。屬于成體干細(xì)胞的MAPC處于分化前期時(shí)，需要增殖到一定程度，才能在不同細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下趨向特定細(xì)胞系分化。因此，前期的增殖對(duì)后期的分化具有非常重要的意義。高糖阻滯Oct4高表達(dá)的MAPC在Gl/S期，可能影響MAPC細(xì)胞DNA合成過(guò)程，導(dǎo)致其誘導(dǎo)分化趨勢(shì)發(fā)生改變。研究顯示，P21和P27通過(guò)抑制E-CDK2復(fù)合體形成及其功能表達(dá)干擾細(xì)胞周期的Gl/S期[4]。高糖通過(guò)TGF-βl介導(dǎo)P21和P27遲滯血管細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞周期的5期[8]。高糖通過(guò)上調(diào)P21蛋白表達(dá)水平遲滯內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞周期[18]。相反，高糖通過(guò)下調(diào)P21而非P27蛋白表達(dá)水平，使處于S期的間質(zhì)細(xì)胞增加，處于Gl期的細(xì)胞減少[19]。TGF-β1通過(guò)調(diào)控P21蛋白表達(dá)水平遲滯人結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，而非P27蛋白。綜上所述，高糖可選擇性調(diào)控CDK-I（例如P21和P27）來(lái)干擾細(xì)胞周期。高糖遲滯MAPC細(xì)胞周期在Gl/S期，研究顯示與選擇性上調(diào)P21表達(dá)水平有關(guān)，而非P27表達(dá)水平，提示P21是阻滯MAPC細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子。

TGF-pi涉及多種細(xì)胞的增殖、遷移、定植及分化過(guò)程，并且是再生血管形成過(guò)程的重要調(diào)控因子[20～22]。包括內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞均可通過(guò)產(chǎn)生的TGF-β1調(diào)控細(xì)胞周期[23]。高糖可作為刺激性因素上調(diào)多種細(xì)胞的TGF-pl表達(dá)水平[24，25]。近期研究顯示，高糖可調(diào)控大鼠胚胎干細(xì)胞TGF-pl表達(dá)水平誘導(dǎo)其增殖[26]。TGF-β1通過(guò)與細(xì)胞膜表面特異性受體的結(jié)合發(fā)揮功能[27]。實(shí)驗(yàn)中利用TGF-β1特異性抗體中和TGF-β1，可有效抑制高糖調(diào)控TGF-βR2表達(dá)水平上調(diào)，高糖遲滯MPAC細(xì)胞周期的作用隨之明顯減弱。研究提示，高糖可調(diào)控TGF-βl相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路干擾MAPC細(xì)胞的細(xì)胞周期。

TGF-pi通過(guò)PI3 -KJAKT和MAPK-ERK磷酸化通路遲滯細(xì)胞周期在Gl期[28]。研究顯示，高糖可以通過(guò)調(diào)控大晟胚胎干細(xì)胞的PI3 -K/AKT及MAPK信號(hào)通路影響細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)水平[29]。同時(shí)，TGF-β1可參與ERKl/2細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控[30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，高糖未能誘導(dǎo)MAPC細(xì)胞的AKT及磷酸化AKT表達(dá)水平發(fā)生明顯改變，PI3 -K/AKT與MAPC細(xì)胞周期調(diào)控?zé)o關(guān)。同時(shí)，高糖誘導(dǎo)P21表達(dá)水平上調(diào)，伴隨P-Smad表達(dá)上調(diào)及CDK2表達(dá)下調(diào)；提示TGF-pi通過(guò)TGF-pR2激活其下游的Smad和非Smad信號(hào)通路。實(shí)驗(yàn)組通過(guò)PD98059特異性抑制Erkl/2表達(dá)，下調(diào)的Samd2/3可以恢復(fù)，提示ERKl/2可以通過(guò)調(diào)控Smad通路影響CDK2表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，高糖通過(guò)ERKl/2信號(hào)通路調(diào)控MAPC細(xì)胞的細(xì)胞周期。

特異性轉(zhuǎn)錄因子Oct4在胚胎干細(xì)胞及許多具有多向分化潛能的細(xì)胞中保持高表達(dá)水平，提示細(xì)胞保持自我再生能力及多向分化潛能，Oct4是公認(rèn)的特異性標(biāo)志[9，10]。在大鼠胚胎干細(xì)胞，Oct4表達(dá)水平隨細(xì)胞周期呈動(dòng)態(tài)變化，在G2期達(dá)到表達(dá)的峰值[13] ?？鼓[瘤藥物諾考達(dá)唑可在C2/M期阻斷人胚胎干細(xì)胞的周期，伴有Oct4表達(dá)下調(diào)；去除藥物影響后，細(xì)胞周期恢復(fù)正常，Oct4表達(dá)未隨之恢復(fù)[31]。在MAPC細(xì)胞中，Oct4表達(dá)水平與細(xì)胞的再生能力、分化潛能相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在高糖刺激性下，當(dāng)細(xì)胞周期進(jìn)程受到到明顯干擾時(shí)，Oct4表達(dá)水平無(wú)明顯改變。說(shuō)明高糖對(duì)MAPC細(xì)胞周期的影響是在其未分化階段，MAPC保有多項(xiàng)分化潛能。

有研究顯示，Gl期的長(zhǎng)短直接影響祖細(xì)胞分化，例如神經(jīng)前體細(xì)胞[32]。高糖干擾MAPC細(xì)胞STAT3和TGF-β1間的平衡，導(dǎo)致其分化趨勢(shì)的改變網(wǎng)。高糖調(diào)控TGF-βl表達(dá)水平，通過(guò)ERKl/2細(xì)胞信號(hào)通路影響Smad或非Smad途徑，上調(diào)P21表達(dá)，抑制CDK2表達(dá)，在Gl/S期遲滯Oct4高表達(dá)MAPC細(xì)胞的周期進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖可以通過(guò)調(diào)控處于未分化期MAPC細(xì)胞（Occ4高表達(dá)）的TCF-β1水平，在細(xì)胞周期層面改變MAPC細(xì)胞的分化趨勢(shì)。