袁麗芳 安娜 王善林 關(guān)淑鸞 王峰 李宗悅 朱寶長

摘要：研究睪丸間質(zhì)細(xì)胞對(duì)小鼠生精恢復(fù)過程的作用，可以為深入理解睪丸精原干細(xì)胞與其微環(huán)境（體）細(xì)胞間的相互關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)選取8周齡健康C57近交系成年雄性小鼠60只，腹腔注射22mg/kg白消安建立小鼠精子發(fā)生受阻模型，隨機(jī)分成1，2--甲磺酸乙烷（ethanel，2-dimethanesulphonate，EDS）處理組、氟他胺處理組和對(duì)照組，每組20只，3d后分別給予EDS腹腔注射（100mg/kg）、氟他胺埋植，對(duì)照組僅注射溶劑、埋植空管，分別在處理后的1個(gè)月內(nèi)每周采樣，Real-time RT-PCR檢測(cè)CSF1.Gdnf、PLZF和Nanog mRNA表達(dá)水平，Gdnf蛋白水平表達(dá)，并在4周時(shí)進(jìn)行睪丸組織HE染色，觀察組織學(xué)變化并對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行量化分析結(jié)果表明，小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞去除及雄激素受體阻斷均能促進(jìn)睪丸損傷后的生精恢復(fù)過程，但是，受體阻斷的效果更強(qiáng)，說明間質(zhì)細(xì)胞除了通過雄激素發(fā)揮作用外還直接對(duì)生精恢復(fù)起著一定的促進(jìn)作用，這種促進(jìn)作用可能是通過分泌CSF1等細(xì)胞因子來實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：間質(zhì)細(xì)胞；生精恢復(fù)；小鼠；睪丸

中圖分類號(hào)：Q28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-7847（2015）01-0006-07

The Role of Leydig Cell for Restoration of Spermatogenesis in Testis of mice

YUANLi-fang1，2，AN Na2，WANG Shan-lin2，GUAN Shu-luan2，WANG Feng2，LI Zong-yue2，ZHU Bao-chang，

（1.College of Mathematics and Computer Science，Shangrao Normal University，Shangrao 334000，Jiangxi，Chian；2.College of Life Science，Capital Normal University，Beijng 100048，Chian）

Abstract：To study the role of Leydig cells inrestoration of spermatogenesis in testis of mice，we compared reestablishment of spermatogenesis in testes with ablation of Leydig cells and blockage of androgen receptors for understanding relationship between spermatogonial stem cells and their microenvironment.Total numbers of 60 male mice（C57）were selected at age of 8 weeks old.Spermatogenesis disruption model was made by intraperitoneal injection with busulfan（22mg/kgBW（body weight））.Then they were randomly divided into 3 groups.Treatments of EDS group（n=20），flutamide group（n=20）and the control group（n=20）were received intraperitoneal in jection of ethane 1，2-dimethanesulphonate（EDS）（100mg/kg BW），flutamide implantation and viechle solution，respectively.The expression of CSF1，Gdnf，PLZF and Nanog mRNA were measured by Real-time RT-PCR at 4 weeks after treatment.In addition，the protein expression of GDNF was assayed by Western blot.The histological changes in testicular tissue were observed under microscope with HE staining at 4 weeks.Although both removal of Leydig cells and blockage of androgen receptors could promote restoration of spermatogenesis in testis of mice，we found that androgen receptor blockage gave rise to a stronger effect.

在生理?xiàng)l件下，睪酮對(duì)于成年動(dòng)物的精子發(fā)生是不可或缺的，然而Ogawa和Dohrinski等在精原干細(xì)胞移植研究中相繼表明[1]，使用GnRH激動(dòng)劑抑制受體動(dòng)物睪酮后能顯著增加精原干細(xì)胞移植后的克隆形成效率，進(jìn)而證實(shí)促進(jìn)精原干細(xì)胞克隆率就是通過抑制睪酮與受體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的，因此，不論何種方法只要抑制了睪酮的作用就能表現(xiàn)出這種促進(jìn)作用（包括GnRH激動(dòng)劑、受體拮抗劑等），其作用機(jī)理至今仍不完全明了。睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cells，LCs）僅占睪丸細(xì)胞總數(shù)的2%～4%，卻是雄性睪丸內(nèi)所有雄激素的唯一來源。然而，睪酮是通過受體來發(fā)揮作用的，研究發(fā)現(xiàn)睪酮受體僅存在于睪丸體細(xì)胞（包括支持細(xì)胞、賴氏細(xì)胞和管周膜細(xì)胞等）上，生殖細(xì)胞本身并沒有睪酮受體，也就是說，睪酮并不直接作用于生殖細(xì)胞，而是通過睪丸體細(xì)胞對(duì)生殖細(xì)胞施加影響的。有研究表明Sertoli細(xì)胞可以通過分泌某些細(xì)胞因子（如GDNF、SCF、ERM等）影響精原干細(xì)胞的增殖[2]，然而，其他睪丸細(xì)胞也對(duì)精子發(fā)生具有一定的貢獻(xiàn)，如賴氏細(xì)胞除了分泌睪酮外也能夠分泌CSF1來影響精原干細(xì)胞[3]，但是，LCs在精子發(fā)生受損后的恢復(fù)過程中是否發(fā)揮作用卻仍然不清楚。本研究通過對(duì)比去除LCs與阻斷雄激素的區(qū)別來推測(cè)睪丸LCs缺失在精子發(fā)生恢復(fù)過程中是否具有雄激素以外的其他作用，為深入理解睪丸精原干細(xì)胞與其微環(huán)境（體）細(xì)胞間的相互關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院品系為C57近交系成年健康雄性小鼠，飼養(yǎng)在本校動(dòng)物中心的屏障環(huán)境內(nèi)，自由飲食，環(huán)境溫度為22～26℃，人工光照周期為12L：12D自動(dòng)控制。

1.2主要試劑

白消安（busulfan）、DMS0、MTT及氟他胺（flutamide）（美國Sigma公司），Trizol及RT-PCR試劑盒（德國TianGen公司），SYBR Green Assay 試劑盒（日本TaKaRa公司），引物由上海Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成，Gdnf抗體（美國Santa公司），一抗β-Actin（鼠源，中杉公司），EDS由本實(shí)驗(yàn)室合成。

1.3小鼠睪丸損傷模型

8周齡雄性C57小鼠60只，25～32g，以溶劑比例（DMS0：水=1：1配制成）4.4mg/mL的溶液，按22mg/kg體重分別給60只小鼠腹腔注射后，隨機(jī)分成EDS處理組、氟他胺處理組和對(duì)照組3組，每組20只。

1.4小鼠LCs去除和氟他胺埋植

EDS處理組在白消安注射3d后腹腔注射100mg/kgEDS，配制方法為稱取200mgEDS粉末，溶于DMS0：水=1：3的10mL溶液中；氟他胺組小鼠頸部皮下埋植兩頭開口5mm長的硅膠管，管內(nèi)填滿氟他胺粉末。

1.5 睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察

EDS和氟他胺處理4周后，處死小鼠，取睪丸，放人苦味酸（Bouin液）中間定15h，常規(guī)制備石蠟切片，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸組織形態(tài)學(xué)切片。統(tǒng)計(jì)曲細(xì)精管直徑（seminifemus tubule diameter）、生精上皮厚度（the thickness of seminiferous epithelium），成型精子頭部數(shù)（sperm head number）及空泡率（vacuoles rate）等組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)，每組中每項(xiàng)指標(biāo)至少統(tǒng)計(jì)10個(gè)切片，100個(gè)曲細(xì)精管。不規(guī)則圓形曲細(xì)精管取最小直徑值，生精上皮厚度取垂直和水平方向4個(gè)生精上皮厚度的平均值，空泡率=產(chǎn)生空泡的曲細(xì)精管個(gè)數(shù)/總曲細(xì)精管數(shù)X100%。

1.6 Real-time RT-PCR檢測(cè)睪丸組織PLZF、 Gdnf、Nanog、CSF1、mRNA表達(dá)

采用Trizol-氯仿抽提總RNA，各組RNA樣本260nm與280nm吸光度（A）值的比值A(chǔ)260/A280）均>1.8，符合PCR試驗(yàn)要求。按RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，加入SYBR Green Assay，反轉(zhuǎn)錄混合體系建立完成后，混勻，進(jìn)行下一步Real time RT-PCR檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)用的是Bio-RAD Real-time RT-PCR儀，mRNA水平用L19作內(nèi)對(duì)照標(biāo)化?；虮磉_(dá)通過各組Ct值間對(duì)照組Ct值間的比值做相對(duì)定量分析各基因的引物及其堿基序列如表1所示。

1.7 MTT法探究不同濃度EDS對(duì)Helas細(xì)胞的損傷

取對(duì)數(shù)生長期的Helas細(xì)胞，以1X105/mL的密度接種于96孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后加入終濃度為0.1mg/mL、1mg/mL、10mg/mL、100mg/mL、1000mg/mL直至飽和濃度的EDS，每組6個(gè)復(fù)孔繼續(xù)培養(yǎng)24h后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，每孔棄舊液培養(yǎng)，并加入20μL、5g/L的MTT原液和180μL無血清培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，4h后棄去培養(yǎng)液并加入150DMSO，待沉淀溶解酶標(biāo)儀測(cè)定570nm波長的吸光度值。

1.8 Western-Blot檢測(cè)睪丸組織Gdnf的蛋白表達(dá)

TRIzol法提取蛋白質(zhì)，Bradford法測(cè)定7d、14d、21d、28d、35d的對(duì)照組、EDS組和氟他胺組共15個(gè)蛋白樣的蛋白濃度，配制12%的分離膠及5%濃縮膠，運(yùn)用Bio-RAD的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，1gBSA加上20μLPBST室溫封閉1h，1：1000—抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，1：2000二抗室溫孵育2h，TBST洗滌3次，將膜取出加顯影液A、B，按照0.5mLA，0.5niLB，4mL水的配制方法，按操作程序進(jìn)行曝光處理，曝光時(shí)間為2～5S。用GAPDH進(jìn)行蛋白檢測(cè)：條帶進(jìn)行圖像分析，測(cè)定灰度值，用β-Actin作內(nèi)參來比較各組Gdnf的相對(duì)表達(dá)差異。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以表示，組間兩兩比較采用T顯著性檢驗(yàn)；顯著性差異，與對(duì)照組相比較，a：P<0.01，b：P<0.05；與EDS組比，c：P<0.01，d：P<0.05。

2 結(jié)果

使用白消安（22mg/kgBW）處理成年小鼠可以部分地去除睪丸內(nèi)的精原干細(xì)胞，使睪丸精子發(fā)生受阻，表現(xiàn)為睪丸質(zhì)量下降，曲細(xì)精管直徑、曲細(xì)精管上皮厚度、精子數(shù)目顯著下降，生精上皮空泡率上升，但是之后將逐漸恢復(fù)，本研究將白消安處理后的小鼠隨機(jī)分為3組，分別使用EDS、flutamide和載體溶劑處理，采樣觀察睪丸組織學(xué)變化和組織內(nèi)不同細(xì)胞因子的變化。

2.1 小鼠睪丸組織曲細(xì)精管直徑、生精上皮厚度、成型精子頭部數(shù)及空泡率比較

EDS及氟他胺處理4周后，EDS和氟他胺處理組睪丸曲細(xì)精管直徑、生精上皮厚度、成型精子頭部數(shù)均顯著大于對(duì)照組（P<0.01），而空泡率則顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。但是，EDS和氟他胺組間差異不顯著（見表2），說明使用EDS去除賴氏細(xì)胞與使用氟他胺阻斷雄激素受體在曲細(xì)精管中精子發(fā)生恢復(fù)中所起到的作用基本相似。此外，通過睪丸組織學(xué)切片觀察發(fā)現(xiàn)，EDS及氟他胺處理4周后，EDS（圖1C、G）及氟他胺（圖1D、H）處理組曲細(xì)精管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞排列緊密，生精上皮厚度正常，管腔內(nèi)可見大量成熟精子，提示此時(shí)小鼠精子發(fā)生恢復(fù)程度較高，而對(duì)照組曲細(xì)精管空泡率明顯，生精上皮厚度變薄，管腔內(nèi)成熟精子較少。說明使用EDS去除賴氏細(xì)胞與使用氟他胺阻斷雄激素受體都能促進(jìn)睪丸損傷小鼠的生精恢復(fù)。

2.2 小鼠睪丸組織中Gdnf、Nanog、PLZFmRNA表達(dá)情況

EDS及氟他胺處理4周后，Real-timeRT-PCR結(jié)果顯示，EDS和氟他胺處理組睪丸組織中Gdnf，Nanog、PLZF mRNA的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（圖2），Gdnf是由Sertoli細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，它能夠通過受體作用于睪丸精原干細(xì)胞，促進(jìn)后者的自我更新，從而促進(jìn)睪丸精子發(fā)生恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)在處理后4周不僅發(fā)現(xiàn)EDS和氟他胺組均顯著高于對(duì)照組，而且發(fā)現(xiàn)氟他胺組顯著高于EDS組，尤其是PLZF的表達(dá)在氟他胺組的水平近4倍于EDS組，由于氟他胺的使用僅在睪酮受體水平阻礙其作用，并不影響LCs的其他功能，而EDS的使用則因?yàn)檎T導(dǎo)賴氏細(xì)胞凋亡而表現(xiàn)為既導(dǎo)致雄激素水平下降又影響賴氏細(xì)胞的功能（包括其可能的細(xì)胞因子分泌），故推測(cè)EDS組與氟他胺組之間的差異主要體現(xiàn)在賴氏細(xì)胞的功能上，EDS處理除了阻斷睪酮的作用外還可能同時(shí)阻斷了其他對(duì)精原干細(xì)胞有促進(jìn)作用的因子。Nanog與PLZF都是由精原干細(xì)胞來源的細(xì)胞因子，兩者在睪丸中的表達(dá)量與對(duì)照組相比都有顯著的增加，且表現(xiàn)為氟他胺組高于EDS組，說明抑制睪酮可以顯著刺激精原干細(xì)胞的增殖，而且僅抑制睪酮比僅抑制睪酮又同時(shí)去除賴氏細(xì)胞的效果更好?？紤]到睪酮受體僅在體細(xì)胞分布，而Gdnf來源于Sertoli細(xì)胞的情況，對(duì)比各處理組Gdnf的表達(dá)趨勢(shì)，提示抑制睪酮對(duì)生精恢復(fù)的作用可能是通過Gdnf來實(shí)現(xiàn)的。

2.3 小鼠睪丸組織CSF1在處理后時(shí)間mRNA表達(dá)情況

KDS及氟他胺處理后1月內(nèi)每周采樣，Real-timeKT-PCR結(jié)果顯示，EDS處理組睪丸組織CSF1 mRNA的表達(dá)量均低于對(duì)照組（1w、2w、3wP<0.01，4wP<0.05）；氟他胺與對(duì)照相比差異不大（見圖3），EDS導(dǎo)致賴氏細(xì)胞凋亡，但是，一個(gè)月后則逐漸恢復(fù)，此處雖然EDS處理引起了細(xì)胞凋亡，但是由賴氏細(xì)胞分泌的CSF1的表達(dá)在處理后一周下降最為明顯，之后逐漸恢復(fù)，與賴氏細(xì)胞的變化趨勢(shì)相似，這表明CSF1表達(dá)與賴氏細(xì)胞的存在數(shù)量基本一致。

2.4 Western-blot檢測(cè)睪丸組織Gdnf的蛋白表達(dá)情況

Gdnf的蛋白表達(dá)量在處理后21?35d，EDS和氟他胺組均顯著高于對(duì)照組（P<0.01）（圖4），也驗(yàn)證了兩種處理方式降低睪酮均能促進(jìn)精子發(fā)生的恢復(fù)，EDS組與氟他胺組比較，氟他胺組顯著高于EDS組（21d，P<0.01；28d，P<0.01），說明去除賴氏細(xì)胞抑制睪酮后蛋白表達(dá)不如僅抑制睪酮的蛋白表達(dá)高，這與4w時(shí)，mRNA表達(dá)趨勢(shì)相符，也進(jìn)一步說明賴氏細(xì)胞對(duì)生精恢復(fù)有貢獻(xiàn)。

2.5 MTT法探究不同濃度EDS對(duì)Helas細(xì)胞的損傷作用

為了探究EDS是否存在某種非特異性作用，本研究特使用體外培養(yǎng)的Helas細(xì)胞作為對(duì)象，將本實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射EDS濃度（100mg/kg）換算為整體循環(huán)濃度為0.1mg/mL，并以此為起始濃度，濃梯度為0.1、1、10、100、1000mg/mL增加直至EDS的飽和濃度（10000mg/mL），以相對(duì)細(xì)胞增殖數(shù)代表細(xì)胞存活率，結(jié)果表明，10mg/mL及以下EDS濃度Helas細(xì)胞存活率與對(duì)照相比差異不大，高于1000mg/mL的EDS濃度開始對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用（見圖5），這說明低濃度的EDS并未出現(xiàn)非特異性細(xì)胞毒性，也表明本實(shí)驗(yàn)所使用的EDS濃度是安全的。

3 討論

睪丸曲細(xì)精管由Sertoli細(xì)胞與發(fā)育狀態(tài)不同的生殖細(xì)胞組成，Sertoli細(xì)胞不僅為生殖細(xì)胞提供發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)與適當(dāng)環(huán)境，同時(shí)也通過分泌細(xì)胞因子對(duì)生殖細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)行調(diào)控，LCs是曲細(xì)精管間質(zhì)中分泌睪酮最重要的內(nèi)分泌細(xì)胞，它對(duì)于雄性的生育能力及第二性征的維持至關(guān)重要。在精原干細(xì)胞移植研究中，人們發(fā)現(xiàn)抑制睪酮能夠提高精原干細(xì)胞移植后的成功率[1]，后來發(fā)現(xiàn)該作用是通過睪酮受體發(fā)揮作用的[4]；此外，在睪丸生精過程受損后的恢復(fù)過程中，抑制睪酮同樣有利于精子發(fā)生的恢復(fù)[5]。

此后還有人發(fā)現(xiàn)睪丸中除了Sertoli細(xì)胞外，賴氏細(xì)胞也對(duì)精子發(fā)生具有重要的作用，然而并未有明確的證據(jù)顯示賴氏細(xì)胞是如何參與精子發(fā)生恢復(fù)的。本研究通過實(shí)驗(yàn)對(duì)EDS組和氟他胺組進(jìn)行比較研究，從而闡明抑制睪酮，間質(zhì)細(xì)胞對(duì)于受損精子的恢復(fù)具有的重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同處理后4周采樣，分別研究Nanog與PLZF基因的表達(dá)量，以期代表精原干細(xì)胞的恢復(fù)狀態(tài)，可以看到Nanog的表達(dá)量與Gdnf基本相似（圖2），但是，因?yàn)闆]有進(jìn)行免疫組化標(biāo)記，尚不能看出二者的顯著區(qū)別：而PLZF和Nanog在氟他胺組的表達(dá)顯著地高于EDS組，說明KDS組的促進(jìn)作用不如氟他胺組，與我們的假說基本吻合，因此推測(cè)，在受損睪丸生精恢復(fù)過程中LCs具有除了雄激素以外的貢獻(xiàn)，Gdnf的蛋白表達(dá)情況也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。Gdnf是由Sertoli細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，它能夠通過其受體而作用于精原干細(xì)胞，促進(jìn)其自我更新，因而參與精子發(fā)生的重建過程，氟他胺和EDS處理都能夠使Sertoli細(xì)胞表達(dá)Gdnf的能力增強(qiáng)，但是氟他胺處理組的作用更強(qiáng)，也說明本研究在組織學(xué)水平觀察到氟他胺和EDS處理對(duì)睪丸受損后恢復(fù)的刺激作用都有可能是通過影響Serlnli細(xì)胞分泌Gdnf，進(jìn)而刺激精原干細(xì)胞增殖來實(shí)現(xiàn)的，盡管還不能完全排除其他機(jī)制的參與，如刺激精原干細(xì)胞各階段的分化過程。

雖然用EDS去除賴氏細(xì)胞和用氟他胺阻斷受體都能夠達(dá)到阻止睪酮作用的目的，表現(xiàn)對(duì)睪丸精子恢復(fù)具有一定促進(jìn)作用，但是，前者在去除賴氏細(xì)胞的同時(shí)也將賴氏細(xì)胞可能的其他分泌物也一同去除了，而后者在不干擾睪酮水平的情況下僅僅阻斷了睪酮通過受體的作用途徑。如果賴氏細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在生精過程恢復(fù)中具有一定的作用，那么，在EDS組中就應(yīng)該表現(xiàn)為促進(jìn)作用的抵消或減弱，否則就表明LCs沒有雄激素以外明顯的作用，從Nonog、PLZF、GDNF及CSF1表達(dá)等方面觀察，本研究結(jié)果都顯示F.DS組低于氟他胺組的現(xiàn)象，故表明LCs在此發(fā)揮著雄激素以外的作用。CSF1是目前已知由賴氏細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子[6]，其主要作用是促進(jìn)精原干細(xì)胞的增殖，在本實(shí)驗(yàn)中CSF1的表達(dá)隨著EDS所誘導(dǎo)的賴氏細(xì)胞凋亡而急劇下降，隨后有逐步升高的趨勢(shì)，這種模式與前人報(bào)道基本一致，但是，CSF1的降低并未在受損睪丸精子發(fā)生恢復(fù)過程中的組織學(xué)指標(biāo)里表現(xiàn)出來（表2），可能存在兩方面的原因：第一，可能是由于組織學(xué)檢驗(yàn)的靈敏度相對(duì)較低，從而導(dǎo)致沒有甄別出；第二，可能是抑制睪酮所出現(xiàn)的促進(jìn)生精恢復(fù)的作用是通過其他途徑起作用的。本研究組織學(xué)采樣點(diǎn)僅設(shè)在處理后4周，其他時(shí)間點(diǎn)則不得而知，LC除了CSF1以外的功能尚不清楚，還需要進(jìn)一步深入研究才能最終理解其作用。

EDS是一種睪丸間質(zhì)細(xì)胞特異性凋亡誘導(dǎo)劑，能殺死睪丸LCs。不少研究者對(duì)其特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明對(duì)大鼠一次性腹腔注射KI）S（75mg/kg）3d后，LCs開始調(diào)亡，1周后體內(nèi)睪酮降至最低，8周后恢復(fù)注射前水平[7、8]，同樣，還有研究證明了EDS對(duì)小鼠也有類似的作用，但其效果不如大鼠敏感[9]，為保障去除LCs的有效性，實(shí)驗(yàn)證明所采用的劑量（100mg/kg EDS）高于大鼠的常用劑量。另外，既然CSF1是間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的，那么EDS處理后，CSF1mRNA表達(dá)量應(yīng)與間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量保持一致，本試驗(yàn)中CSF1mRNA的表達(dá)量均低于對(duì)照組（1w、2w、3wP<0.01，4wr<0.05），氟他胺與對(duì)照相比差異不大，說明這個(gè)濃度的EDS對(duì)于去除小鼠LCs是有效的

為了進(jìn)一步驗(yàn)證EDS本身是否對(duì)小鼠除賴氏細(xì)胞外的其他細(xì)胞造成毒性或損傷，本研究通過MTT法將不同濃度的KDS作用于體外培養(yǎng)的Helas細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)濃度的EDS并未出現(xiàn)非特異性細(xì)胞抑制作用，而高于本實(shí)驗(yàn)百倍以上的濃度才開始顯示出Helas細(xì)胞的存活率的下降趨勢(shì)。因此，排除了本實(shí)驗(yàn)中EDS本身的毒性對(duì)其他細(xì)胞作用的可能性。

目前精原干細(xì)胞的表面標(biāo)志并未在業(yè)界達(dá)成一致，其中，PIZF是轉(zhuǎn)錄抑制因子P0Z家族成員之一，僅在早期未分化的精原細(xì)胞中表達(dá)，是精原干細(xì)胞自我更新的必需因子[10]，常用于精原干細(xì)胞的富集和純化Nanog是在干細(xì)胞表達(dá)的另一個(gè)基因[11]，有報(bào)道稱Nanog僅在表達(dá)PLZF的部分精原干細(xì)胞中表達(dá)[12]，提示在標(biāo)記精原干細(xì)胞方面Nanog的特異性更強(qiáng)，但是本實(shí)驗(yàn)并未觀察到更有意義的區(qū)別。

白消安是一種烷化劑，能夠在體內(nèi)非特異性地消除干細(xì)胞，包括生殖干細(xì)胞，臨床上常用于腫瘤治療，而在治療過程中常伴隨著生育力的下降[13]。因此，本研究在實(shí)踐中對(duì)于恢復(fù)精子發(fā)生的臨床治療具有一定的參考價(jià)值，同時(shí)，為在理論上重新認(rèn)識(shí)干細(xì)胞與微環(huán)境（niche）的關(guān)系也提供了新的思路。精原干細(xì)胞的增殖受到其微環(huán)境的精確調(diào)控，雖然niche的組成目前還不完全清楚，有人認(rèn)為niche就應(yīng)該是與精原干細(xì)胞直接接觸的Sertoli細(xì)胞，也有人認(rèn)為niche應(yīng)該包括所有對(duì)其調(diào)控行影響的細(xì)胞，而本研究發(fā)現(xiàn)賴氏細(xì)胞也對(duì)niche有一定的貢獻(xiàn)，提示人們?cè)谡J(rèn)識(shí)niche的過程中位該將眼光放得更寬些，也可能它比人們想象中的更復(fù)雜，而這一問題的解決可能對(duì)研究各種干細(xì)胞niche間關(guān)系都有著積極的生物學(xué)意義

參考文獻(xiàn)（References）：

[1]OGAWAT.DOBRINSKII，AVARBARBOCKMRetal.Le-uprolide，agonadotropinreleasinghormoneagonist，enhancescolonizationafterspennatogonialtransplantationintomousetestes[J].TissueCell，1998.30（5）：583-588.

[2]OATLEYJM，AVARBARBOCKMR，TELARANTAAI.etal.Identifyinggenesimportantforspermatogonialstemcellselfrenewalandsurvival[J].ProceedingsoftheNationalAcade-myofSciencesoftheUnitedStates，2006.103（25）：9524-9529.

[3]李玲玲，劉洋，金波.精原干細(xì)胞微環(huán)境的生物學(xué)特性[J].中華男科學(xué)雜志（LILLLIUY，JINB.Biologicalcharacteristicsofspermatogonialstemcellmicroenvironment[J].NationalJour-nalofAndrology），2012，18（4）：359—363.

[4]WAYNECM.SUTTONK.WILKINSONMF.ExpressionofthepemhomeoboxgeneinSertolicellsincreasesthefrequencyofadjacentgermcellswithdeoxyribonucleicacidstrandbreaks[J].Endocrinology2002，143（11）：4875-4885.

[5]MEISTRICHML，WILSONG，HUHTANIEMII.Hormonaltreatmentaftercytotoxictherapystimulatesrecoveryofsper-matogenesis[J].CancerResearch.1999，59（15）：3557-3560.

[6]OATLEYJM.OATLEYMJ，AVARBOCKMR，etal.Colonystimulatingfactor1isanextrinsicstimulatorofmousesper—matogonialstemcellself-renewal[J|.Development，2009，136（7）：1191-1199.

[7]KERRJB.DONACHIEK.ROMMERTSFFG.Selectivede-structionandregenerationofratLeydigcellsinvivo：Anewmethodforthestudyofseminiferoustubular—interstitialtissueinteraction[J].CellandTissueResearch，1985，242（1）：145-156.

[8]MORRISAJ.TAYLORMF，MORRISSID.Leydigcellapoptosisinresponsetoethanedimethanesulphonateafterbothinvivoandinvitrotreatment[J].Andrology，1997，18（3）：274-280.

[9]吳利平，韓亞娟，朱航，等.EDS誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3凋亡中NDRG2的表達(dá)及意義.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）（WULP，HANYJ，ZHUH，etal.ExpressionofNDRG2geneintheEDSinducedapoptosismodelofmouseLeydigcellTM3[J|.JournalofXianJiaoTongUniversity）（Med?icalSciences），2012，3（6）：715-718.

[10]KRETZMANNNA，CHIELAE，MATTEU.et（d.N-acetyl-cysteineimprovesantitumouralresponseofinterferonalphabyNF-kBdownregulationinlivercancercells[J].ComparativeHep-atology，2012，11（1）：4.

[11]HARTAH，HARTLEYL，LBRAHIMM，etal.Identification，cloningandexpressionanalysisofthepluripotencypromotingNanoggenesinmouseandhuman[J|.DevelopmentalDynamics，2004，230（1）：187-198.

[12]ZOHNIK，ZHANGX，TANSL.etal.Theefficiencyofmalefertilityrestorationisdepedentontherecoverykineticsofspermatogonialstemcellsaftercytotoxictreatmentwithhusul-faninmice[J].HumanReproduction，2012，27（1）：44-53.

[13]李景平，郭文彬，何金參，等.應(yīng)用白消安構(gòu)建唯支持細(xì)胞綜合征小鼠動(dòng)物模型[J].中華男科學(xué)雜志（LIJing-pinp.GUOWen-bin，HEJin-sen，etal.ApplicationsofbusulfantobuildmouseSertolicellsonlymodels[J].NationalJournalofAndrol-ogy），2013，19（4）：300-305.