佘冬蓮 陳文娟 王艷杰 周毅 劉瓊 李建中

摘要：利用KT-PCK技術(shù)從草魚性腺中克隆出兩種促性腺激素受體基因（FSHR和LHR），采用N-J法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)IVr-PCK及Keal-timePCR技術(shù)對(duì)FSHR和LHR在成體草魚不同組織中的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)和LHR在草魚卵巢、精巢中表達(dá)明顯，表達(dá)量隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育逐漸增高，以上結(jié)果為進(jìn)一步探討GTHR在魚類生殖周期中的生理功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：草魚；促性腺激素受體；基因克??；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：Q785；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847（2015）01-0039-05

MolecularGeneCloningandExpressionofGonadotropinReceptorsfromCtenopharyngodonidella

SHEDong-lian，CHENWen-juan，WANGYan-jie，ZHOUYi，LIUQiong，LIJian-zhong

（CollegeofLifeSciences，HunanNormalUniversity，Changsha410081，Hunan，China）

Abstract：Twotypesofgonadotropinreceptors（FSHRandLHR）wereclonedfromthegonadsofgrasscarphyRT-PCR.Thephylogenetic*treeofGTHRbetweendifferentspeciesbyN-Jmethodwasconstructed.ThetemporalandspatialexpressionofdifferenttissuesinadultgrasscarphyRT-PCRandReal-timePCRwasanalyzed.TheresultindicatedthatFSHRandLHRweremuchhigherexpressedingonads，andtheexpres?sionlevelwassignificantlyincreasedinmatureoocytes.TheseresultslaidafoundationforthefurtherstudyonGTHRreproductivefunctionsinfish.

Keywords：grasscarp；gonadotropinreceptors；genecloning；expressionanalysis

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：039?043）

脊椎動(dòng)物的生殖周期主要由下丘腦一垂體一性腺軸調(diào)控，而垂體分泌的促性腺激素（go-nadotropinhormone，GTH）在脊椎動(dòng)物的生殖周期調(diào)控中占據(jù)中心地位，是促進(jìn)性腺發(fā)育與成熟的關(guān)鍵性激素[1、2]。但是，促性腺激素必須與相應(yīng)的受體結(jié)合才能行使其生物學(xué)功能，通過(guò)對(duì)促性腺激素受體（gonadotropinreceptors，GTHR）的研究有利于我們進(jìn)一步了解GTH在魚類生殖周期調(diào)控中的生物學(xué)功能[3]。在魚類中，存在兩種類型的促性腺激素受體GTHRⅠ和GTHRⅡ，——對(duì)應(yīng)著哺乳動(dòng)物中的促卵泡素受體（follicle-stimulatinghormonereceptor，F(xiàn)SHR）和促黃體生成素受體（luteinizinghormonereceptor，LHR）[4-7]。到目前為止，F(xiàn)SHR和LHR基因已經(jīng)在日本鰻鱺japonica）、非洲鯰魚（Clariasgariepinus）、斑馬魚（Daniorerio）、大西洋娃（Scdmosalar）、斜帶石斑魚（Epinepheluscoioides）、西氏擬隆頭魚（sieboldi）、牙漢魚（Odontesthesbonariensis）等多種硬骨魚[8-14]的性腺中被克隆，但在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。

草魚（Ctenopharyngodonif/eWa）屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科魚類，是我國(guó)四大家魚之一，是內(nèi)地淡水經(jīng)濟(jì)魚類中價(jià)值較高的優(yōu)質(zhì)魚類之一。本實(shí)驗(yàn)室在草魚腦垂體的起源和發(fā)生以及外源激素對(duì)草魚腦垂體GTH細(xì)胞的影響等方面巳經(jīng)做了大量的工作但是，在分子生物學(xué)方面，我們對(duì)草魚生殖周期調(diào)控的分子機(jī)理還知之甚少，有必要進(jìn)行深入的研究。本研究從分子生物學(xué)方面著手，對(duì)草魚FSHR和LHR基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)及分析，對(duì)于進(jìn)一步闡明促性腺激素及其受體在硬骨魚類生殖周期調(diào)控中作用的分子機(jī)制，完善魚類（特別是鯉科魚類）的繁殖內(nèi)分泌學(xué)研究有重要的理論意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌E.coli DH5α湖南師范大學(xué)魚類發(fā)育實(shí)驗(yàn)室保存，本實(shí)驗(yàn)所用草魚來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖基地。

1.1.2試劑

無(wú)水乙醇、二甲苯、石蠟、甲醛、冰醋酸、苦味酸、蘇木精、中性樹(shù)膠（國(guó)產(chǎn)）；RevertAidFirst-strandcDNASynthesisKit、dNTP、TaqDNApoly?merase、DnaseI酶（美國(guó)Fermentas公司）；瓊脂糖（西班牙BI0WEST公司）、胰蛋白胨、酵母提取物（0X0ID），焦碳酸二乙醋（diethylpyrocarbonate，DE-PC），氨芐青霉素、EB染液、DNA膠回收試劑盒（Sangon公司）；E.Z.N.A.TotalRNAKitI（美國(guó)Omega公司）；pMD18-TVector，DNA純化試劑盒（日本Takara公司）；SYBRqPCRMix（東洋紡生物科技日本有限公司）。實(shí)驗(yàn)中所用引物均來(lái)自于試劑盒本身附帶或由Sangon公司合成，所有測(cè)序均由南京金斯瑞公司測(cè)序儀完成。

1.2方法

1.2.1目的基因克隆

用E.Z.N.ATotalRNAKitI試劑盒從草魚腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、腸、卵巢、精巢等組織分離出總RNA，用RevertAidFirst-Strandc.DNASynthesisKit試劑盒以oligo-dT-3'Adaptor為引物合成cDNA的第一條鏈，根據(jù)已知草魚的FSHR和LHR的開(kāi)放閱讀框序列，用PrimerPrimeier5.0軟件設(shè)計(jì)FSHR和LHR特異性引物，用嵌套式PCR提高其特異性。3'RACE的特異引物為正向引物。

PCR擴(kuò)增程序按如下程序進(jìn)行：94～95T預(yù)變性3-5min；94-95℃，0.5-2min；37-70℃；，0.5～2min；70-750.5-1min；25-35個(gè)循環(huán)，最后70-75℃延伸5-10min。按UNIQ-10柱式DNA膠回收純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化回收。將回收產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，由南京金斯瑞公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)與引物拼接后，在NCBI上的BLAST（httpy/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進(jìn)行同源性物種比對(duì)，沒(méi)有堿基差異，確定克隆序列為目的序列。

1.2.2系統(tǒng)進(jìn)化分析

從GenBank中搜索日本鰻鱺、非洲鯰魚、斑馬魚、大西洋鮭、斜帶石斑魚、西氏擬隆頭魚、牙漢魚、小家鼠musculus）、雞（Gallusgallus）和人（homosapiens）的GTHR序列，運(yùn)用MEGA6.0軟件以N-J法根據(jù)不同物種構(gòu)建出FSHR和LHR的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3LHR和FSHR在草魚成體不同組織的表達(dá)分析

將提取的腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、腸、卵巢、精巢等組織材料質(zhì)量較好的RNA，按照1.2.1的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，只需把3sitesAdaptorPrimer換成Oligo（dt）。以β-actin為內(nèi)參作對(duì)照，按照1.2.1的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系擴(kuò)增表1的特異性引物后電泳檢測(cè)。然后采用ABI7900HTReal-timePCRSystems進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)程序?yàn)?5℃，2min；95℃，10min，之后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)（95℃，15s，60℃，45s）。設(shè)置在60℃，45s退火這一過(guò)程收集熒光。利用Livark等[17]提出的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，對(duì)相對(duì)定量（relative quantification，RQ）結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用溶解曲線法檢測(cè)PCR引物結(jié)合的特異性。

1.2.4LHR和FSHR在草魚各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

將通過(guò)波恩試劑固定的卵巢材料進(jìn)行鑒定后，?、?、Ⅲ、V期的雌性草魚卵巢組織RNA，用RevertAidFirst-StrandcDNASynthesisKit試劑盒以O(shè)ligo（dT）18為引物合成cDNA的第一條鏈，根據(jù)已知草魚的FSHR和LHR的開(kāi)放閱讀框序列設(shè)計(jì)合成Real-timePCR引物，引物如表2所示。然后再按照1.2.3的過(guò)程做Real-timePCR。

2結(jié)果與分析

2.1RACE擴(kuò)增結(jié)果

提取草魚性腺組織的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄形成的CDNA為擴(kuò)增模板，根據(jù)已知草魚的FSHR、LHR的開(kāi)放閱讀框序列，用PrimerPrimeier5.0軟件分析設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)2次嵌套式PCR擴(kuò)增出FSHR的3'端序列，結(jié)果如圖1所示，其片段大小為390bp，在NCBI上經(jīng)過(guò)Blast對(duì)比和同源性分析，證實(shí)獲得的目的序列為草魚促濾泡素激素受體FSHR的3'末端序列（草魚FSHR在GenBank搜索序列號(hào)為KJ742829）。

2.2FSHR和LHR的系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)不同物種構(gòu)建出的FSHR和LHR的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分別如圖2和圖3所示，結(jié)果表明，草魚的FSHR與斑馬魚、非洲鯰魚的相似性最高，草魚的LHR與斑馬魚的相似性最高。

2.3LHR和FSHR在草魚成體不同組織的表達(dá)分析

草魚的腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、腸、卵巢、精巢組織的總RNA提取結(jié)果如圖4所示，以反轉(zhuǎn)錄形成的各組織cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示草魚GTHR在腸、腎臟和性腺組織中特異性表達(dá)，如圖5所示。

運(yùn)用相對(duì)定量PCR技術(shù)比較LHR和FSHR在草魚各組織中的特異性表達(dá)量，結(jié)果如圖6和圖7所示：在腸、腎臟、卵巢和精巢組織中特異性表達(dá)量分別為1、1.050、69.264和54.278；FSHR在肝臟、腎臟、卵巢和精巢組織中特異性表達(dá)量分別為1、1.105、68.788和60.368。數(shù)據(jù)顯示在草魚的腸、腎臟和卵巢和精巢組織中LHR的特異性表達(dá)量和草魚肝臟、腎臟和卵巢和精巢組織中FSHR的特異性表達(dá)量相近，且LHR和FSHR在性腺組織中的表達(dá)量均遠(yuǎn)高于其他組織中的表達(dá)量。

2.4LHR和FSHR在草魚卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

運(yùn)用相對(duì)定量PCR技術(shù)分析LHR和FSHR在Ⅱ、Ⅲ、V期卵巢組織中的特異性表達(dá)量，結(jié)果如圖8所示：LHR在Ⅱ、Ⅲ、V期卵巢組織中特異性表達(dá)量分別為1、5.500、40.278；FSHR在Ⅱ、Ⅲ、V期卵巢組織中特異性表達(dá)量分別為1、8.688、58.368。結(jié)果表明LHR和FSHR的特異性表達(dá)量隨著性腺的發(fā)育而不斷增加，此外，兩者在V期的卵巢組織中的特異性表達(dá)量明顯高于Ⅱ、Ⅲ期卵巢組織中的特異性表達(dá)量，并且FSHR在卵巢組織中的特異性表達(dá)量比LHR高。

總之，本研究成功地克隆出了草魚的FSHR和LHR基因。對(duì)組織表達(dá)特異性的RT-PCR的分析表明，草魚的LHR在精巢、卵巢、腎臟和心臟組織中有表達(dá)，F(xiàn)SHR在精巢、卵巢、腎臟和腸組織中有表達(dá)，并且兩者在性腺組織內(nèi)的表達(dá)量比其他組織高很多，在對(duì)人類胚胎和成體時(shí)期的研究中也有關(guān)于LHR在性腺外的組織表達(dá)的記錄，這說(shuō)明促性腺激素受體可能對(duì)除性腺以外的組織有一定的作用[18]。該結(jié)果為進(jìn)一步研究促性腺激素受體對(duì)非性腺組織的影響以及這種影響引起的生理意義奠定了基礎(chǔ)。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明了FSHR和LHR在草魚卵巢組織中的特異性表達(dá)量隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育逐漸增高，并且在卵巢組織中的特異性表達(dá)量比LHR高。LHR和這種時(shí)空表達(dá)模式與其他魚類在性腺組織中的表達(dá)是平行的這對(duì)于研究其他魚類的表達(dá)模式具有一定的參考作用。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明草魚與斑馬魚相似性最近，與其他魚類的相似性也高于人、小家鼠和雞，這與形態(tài)學(xué)上的系統(tǒng)進(jìn)化分析是一致的。

[1]劉筠.中國(guó)養(yǎng)殖魚類繁殖生理學(xué)[Ml.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社

（LIU Yun. China Farmed Fish Reproduction Physiology[M|.Beijing： China Agriculture Press）， 1993. 42-55.

[2]林浩然.魚類生理學(xué)[M].廣州：中山大學(xué)出版社（LIN Hao-ran. [12] Fish Physiology [Ml. Guangzhou： Sun yat—sen University Press），2011. 240-256.

[3]牛艷東.鳙魚促性腺激素基因的克隆表達(dá)和序列分析[D].長(zhǎng)沙：湖南師范大學(xué)（NIU Yan-dong. Cloning， expression and sequence analysis of gonadotropin subunits c.DNA in ihe big— [13] head carp （HypophthaLmichthys nob ills ）[D]. Changsha： Hunan Normal University）， 2009. 42-43.

[4]KUMAR R S， TJIRI S， TRANT J M. Molecular biology of thechannel catfish gonadotropin receptors： 1. Cloning of a functional luteinizing hormone receptor and preovulatory induction of gene expressionfj]. Biology of Reproduction. 2001. 64（3）： 1010- 1018.

[5]KUMAR R S， IJIRI S， TRANT J M. Molecular biology of thechannel catfish gonadotropin receptors： 2. Complementary DNA cloning，functional expression， and seasonal gene expres?sion of the follicle-stimulating hormone receptor[j]. Biology of Reproduction， 2001， 65（3）： 710-717.

[6]VISCHER H F， BOGERD J. Cloning and functional character?ization of a gonadal luteinizing hormone receptor complemenlary DNA from the African catfish（C/mas gariepinus）[J]. Biology of Reproduction， 2003， 68（1）： 262-271.

[7]BOGERD J， BLOMENROHR M， ANDERSSON E， et al. Dis-crepancy between molecular structure am] ligand selectivity of [171 a testicular follicle-stimulating hormone receptor of the African ratfish （Clarias gariePinus）[J]. Biology of Reproduction. 2001，64（6）： 1633-1643. [18]

[8]JENG S R. YUEH W S， CHEN G R， et al. Differential expres?sion and regulation of gonadotropins and their receptors in the Japanese eel （A ngiiilla j（if）onicn）[]＼. General and Comparative Endocrinology， 2007， 154（1）： 161 -173.

[9]VISCHER H F， GRANNEMAN J C， LINSKENS M H， et al. Both recombinant African catfish LH and FSH are able to activate the African catfish FSH receptoifj]. Molecular F.nflocrinolo- gy， 2003， 31（1）： 133-140. [201

[10]SO W K， KWOK H F， GE W. Zebrafish gonadtropins and their receptors： II. Cloning and characterization of zebrafish follicle stimulation hormone （FSH） and luteinizing hormone （LH） subunits-their spatial -temporal expression patterns and receptor specificity [J]. Biology of Reproduction， 2005， 72（6）： 1382-1396.

[11]MAUGARS G， SCHMITZ M. Molec ular cloning and character?ization of FSH and LH receptors in Atlantic salmon （Scdmonsalar L）[J]. General and Comparative Endocrinology， 2006， 149（1）：108-117.

[12]HU X， LIU X， ZHANG H. et al. Expression profiles of go-nadotropins and their receptors during 17a-methyltestosterone implantation—induced sex change in tlie orange—spoiled wmiper （Epinephelus coioides）[J]. General and Comparative Endocrinology， 2011. 172（6）： 268-276.

[13]KITANO H， IRIE S， OHTA K， et al. Molecular cloning of two gonadotropin receptors and their distinct mRNA expression profiles in daily oogenesis of the wrasse Pseudolahrus sieboldi[J] Biology of Reproduction. 201 1. 84（2）： 1 171-1 181.

[14]SHINODA T， MIRANDA L A， OKUMA K， el a！. Molecular cloning and expression analysis of FSHR and I .HR in relation to FSHR and LHR subunits during the period of teniferature-dependent sex determination in pejenev Odonteslhes Ijonaricnsis[J]. Endocrinology， 2010.151（6）： 2349-2360.

[15]劉瓊.魚類促性腺激素受體的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究（LIUQiong.Progresses on the gonadotropin receptors in lish[J]. Life Science Research）. 2010， 14（2）： 263-267.

[16]魯雙慶，劉少軍.草魚性成熟前后垂體組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)[J]. 湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)（LU Shuang-qing， LIU Shao- jun. Studies on histological and ultra-stmcture of the imma?ture and the mature AdenohyPoPhvsis ol Clenopharnigoflon Idellusf]]. Journal of Natural Science of Hunan Normal IJniversi- ty）， 1996， 19（3）：76-86.

[17]LIVARK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using Real-time quantilative PCR and the 2（- DeltaDelta C （T）） method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[18]GRZEGORZEWSKA A K. SECHMAN A. PACZOSKA-KI.IAS- IEWICZ H E， et al. The expression of pituitary FSH beta and LHheta mRNA and gonadal FSH and LH receptor mRNA in the chicken eml）ryo[J]. Biology of Reprodution. 2009. 9（3）： 253- 269.

[19]SEGAI.OFF D L. Regulatoiy proc-esses governing the cell surface expression of LH and FSH receptorslJ）. Suhcellular Bioclifm istry， 2012， 63（1）： 113-129.

[20]KANAMOR1 A， NAGAHAMA Y. Developmental changes in the properties of gonadolropin receptors in the ovarian follicles of amago salmon （Oncorhynchus rliodurus） during oogenesis[J]. General and Comparative Endocrinology. 1988. 72（1）： 25-38.

[21]LE G F， BRETON B. BOUGOUSSA M. Gonadolmpic hormone（GtH） receptors in the teslis of the trout salmo gaindneri：in vitro studies[J]. Fish Physiology and Biochemistry，1988. 5（4）： 209-217.