楊成良 鄒黎黎

摘要：迄今為止，已有多達(dá)上百種的細(xì)胞穿膜肽（cell-penetratingpeptides，CPPs）被發(fā)現(xiàn)報(bào)道，但這類多肽分子的入胞能力參差不齊，限制了其作為藥物載體的應(yīng)用。雖然已有多種實(shí)驗(yàn)方法可用于細(xì)胞穿膜肽入胞的檢測(cè)，但由于缺乏通用的技術(shù)來確切證實(shí)CPPs的入胞能力，所以應(yīng)當(dāng)結(jié)合使用多種方法以降低誤差。對(duì)不同的技術(shù)在檢測(cè)CPPs入胞時(shí)的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行比較，并針對(duì)性地提出比較理想的解決方案，可為制訂CPPs入胞標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)步驟提供一些參考。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞穿膜肽：熒光分析；電子顯微鏡；生物效應(yīng)

中圖分類號(hào)：Q819 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847（2015）01-0080-05

AnOverviewofDetectionMethodsofTransmembraneAbilityofCell-penetratingPeptides

YANGCheng-liang1，ZOULi-li2*

（1.ThePeople，sHospital，ChinaThreeGorgesUniversity，Yichang443002，Hubei，China；2.MedicalSchool，ChinaThree GorgesUniversity，Yichang443002，Hubei，China）

Abstract：Hundredsofcell-penetratingpeptides（CPPs）havebeenfoundandreported.Sincetheirtrans-membraneabilitiesareuneven，limitingtheirapplicationasthedrugcarriers，yetneedsomeeffectiveanaly?sistechniquestocompare.AlargenumberofexperimentscanbeusedtodetectthepenetratingabilitiesofCPPsintothecells，sincethereisnouniversalmethodcanconfirmthecapacity，avarietyofmethodsshouldbeusedinconjunctiontoreducetheerrors.ThuscomparingtheadvantagesanddisadvantagesofdifferentdetectiontechniquesofpenetratingabilitiesofCPPsintocellscanraisetheidealsolutioninordertostan-dardizethedetectionsteps.

Keywords：cell-penetratingpeptides；fluorescentanalysis；electronmicroscopes；biologicaleffect

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：080?084）

1965年，Ryser等研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝取組蛋白的速度是血清白蛋白的3000倍，并且血清白蛋白中加入組蛋白后能顯著提高腫瘤細(xì)胞攝取血清白蛋白的能力（50倍），這是研究史上首例關(guān)于多肽分子能協(xié)助生物活性分子穿過細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層的報(bào)道[1]。1994年，這種具有穿膜能力的多肽分子被正式命名為細(xì)胞膜穿透肽（cell-pene-tratingpeptides.CPPs）或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（proteintransductiondomains，PTDs）[2]。CPPs是具有細(xì)胞膜穿透能力的小分子多肽，能攜帶生物活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，既不影響轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的生物活性也不會(huì)損傷細(xì)胞，是一種非常理想的運(yùn)載工具。但CPPs的入胞能力參差不齊，限制了其作為藥物載體的應(yīng)用，因而需要一些確切的手段對(duì)CPPs進(jìn)行篩選、比較。許多課題組在評(píng)估CPPs穿膜時(shí)，都有自己最優(yōu)先的方法，但這些方法是否最適宜卻值得考量。本文擬比較不同的技術(shù)檢測(cè)CPPs穿膜的優(yōu)缺點(diǎn)，并針對(duì)缺陷提出比較理想的解決方案，以期為CPPs穿膜標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)進(jìn)程提供一些參考。

1熒光分析

熒光分析法是評(píng)估cpps穿膜最常見的方法。多肽分子首先用熒光素標(biāo)記，然后通過不同的技術(shù)手段對(duì)穿膜效率進(jìn)行檢測(cè)，包括熒光顯微鏡觀察、高效液相色譜法、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)、熒光光譜測(cè)定法。如Fischer等成功應(yīng)用熒光顯微鏡比較了來源于果蠅觸角基因同源結(jié)構(gòu)域蛋白（antennapediahomeodomainprotein，AntpHD）的多肽分子與來源于卡波氏瘤成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）的膜上轉(zhuǎn)移序列（membrane trans-locatingsequence，MTS）的入胞效率，結(jié)果顯示AntpHD來源的多肽分子是FGF來源的多肽分子穿膜效率的3～4倍[3]。盡管所有的熒光分析技術(shù)都能檢測(cè)CPPs的穿膜，但需要注意的是考慮到熒光可能粘附在細(xì)胞表面，因此即使檢測(cè)到熒光基團(tuán)的攝取也不能直接等同于多肽分子的穿膜。此外，某些熒光基團(tuán)可能會(huì)對(duì)多肽分子的穿膜效率及胞內(nèi)分布產(chǎn)生影響[3-5]（表1）。

1.1熒光顯微鏡觀察

使用熒光顯微鏡除了能提供CPPs的穿膜信息以外，它的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是能夠利用白光下的細(xì)胞形態(tài)及染色（例如碘化丙啶）情況來確定細(xì)胞活性，因?yàn)橹挥屑?xì)胞膜受損的細(xì)胞才能被染色。2001年以前，研究者利用熒光顯微鏡探討CPPs的穿膜機(jī)制時(shí)都是觀察多肽分子進(jìn)入固定細(xì)胞的情況。然而，Lundberg等發(fā)現(xiàn)由于熒光顯微鏡并不能分辨多肽分子是結(jié)合在細(xì)胞膜上還是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因而一定程度上影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性[6]。近年來新興的共聚焦顯微鏡因其具有完整顯示活細(xì)胞聚焦平面的能力，彌補(bǔ)了熒光顯微鏡觀察的技術(shù)缺陷如Richard等成功利用共聚焦顯微鏡觀察到TAT及多聚精氨酸（polyarginine）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并主要定位于細(xì)胞核[7]，因而特別推薦熒光顯微鏡配合使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，能準(zhǔn)確地對(duì)CPPs進(jìn)行亞細(xì)胞定位，使得對(duì)CPPs穿膜的檢測(cè)更具說服力。Jones等成功應(yīng)用共聚焦顯微鏡結(jié)合熒光顯微鏡觀察了antennapadia（Antp）及TAT的穿膜情況，結(jié)果顯示兩者均穿膜進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)，并且穿膜作用是脂筏依賴的內(nèi)吞作用而非網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用[4]。

雖然熒光顯微鏡幾乎是唯一能定性分析CPPs入胞的方法，并且這種技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，但它較費(fèi)時(shí)費(fèi)力且不能同時(shí)分析多個(gè)樣本。此外，CPPs進(jìn)入細(xì)胞后并不十分穩(wěn)定，容易發(fā)生降解，從而導(dǎo)致圖像不清晰。因而特別推薦熒光顯微鏡結(jié)合使用其他的觀察技術(shù)來確定多肽分子是完整的還是降解的，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。如Adams等成功利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）實(shí)時(shí)分析細(xì)胞穿膜肽H2N-aha-R-CONH2及H2N-GGR10-CONH2對(duì)HeLa細(xì)胞的穿膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的入胞都具有時(shí)間依賴性，并且最終入胞的完整多肽分子與在胞外時(shí)基本持平[8、9]。

1.2高效液相色譜法

多肽分子的降解是影響CPPs穿膜測(cè)定的重要因素，如Oehlke等將經(jīng)過化學(xué)修飾的多肽分子FLUOS-KLALKLALKALKAALKLA-NH2，吸附在細(xì)胞膜表面以增加胞膜的疏水性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這種經(jīng)過修飾的多肽分子發(fā)生降解的幾率顯著降低[10]。此實(shí)驗(yàn)強(qiáng)調(diào)了多肽分子降解的重要影響。反相高效液相色譜法（reversed-phasehighperformanceliquidchromatography，RP-HPLC）可利用待測(cè)樣品中各成分與色譜柱中固定相發(fā)生作用的不同，在檢測(cè)器中出現(xiàn)不同的信號(hào)峰，從而將完整的多肽分子與發(fā)生降解的多肽分子區(qū)分開來。Palm等成功地運(yùn)用KP-HPLC定量分析了MAP及pene-tratin在細(xì)胞內(nèi)的降解情況，結(jié)果顯示進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的多肽分子呈兩極分化趨勢(shì)，其中一部分迅速降解，另一部分一直保持穩(wěn)定[11]。雖然RP-HPLC可有效定量測(cè)定入胞及降解的多肽分子，但由于該色譜分析法是建立在待檢成分與間定相相互作用的基礎(chǔ)上的，因而對(duì)組成多肽分子的氨基酸種類有一定的要求，并且HPLC價(jià)格昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室沒有這個(gè)設(shè)備且儀器的操作需要一定的經(jīng)驗(yàn)，因而不是十分經(jīng)濟(jì)便利。

1.3熒光激活細(xì)胞分選術(shù)

檢測(cè)CPPs穿膜最經(jīng)典的熒光分析法是熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（fluorescence activatedcellsorting，F(xiàn)ACS），這是一種依賴熒光對(duì)單一細(xì)胞系進(jìn)行分選的技術(shù)，通過這種方法可在定量分析CPPs穿膜的同時(shí)辨別靶細(xì)胞是活細(xì)胞還是死細(xì)胞此外，cpps孵育后必須用酶處現(xiàn)細(xì)胞，例如胰蛋白酶或鏈酶蛋白酶，可去除結(jié)合于膜上的多肽分子，因此FACS最大的優(yōu)勢(shì)是能夠測(cè)定CPPs的轉(zhuǎn)導(dǎo)比率（多肽分子進(jìn)入一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的CPPs的量）[7]。大部分熒光技術(shù)都不能確定多肽分子是結(jié)合在細(xì)胞膜表面，是錨定在膜上還是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的，而熒光激活細(xì)胞分選術(shù)能彌補(bǔ)這個(gè)缺陷。如Jones等成功應(yīng)用FACS對(duì)Antp、TAT、transportan（TP）及polyarginine的穿膜情況進(jìn)行了比較，研究發(fā)現(xiàn)它們?cè)诎麅?nèi)表現(xiàn)出非常相似的代謝動(dòng)力學(xué)特性，此外polyarginine與TP攜帶貨物的能力最強(qiáng)（pol-yarginine=TP>Antp>TAT），而Antp的細(xì)胞毒性最低（Antp

1.4熒光光譜測(cè)定法

當(dāng)需要一次性對(duì)大量的多肽分子進(jìn)行穿膜分析時(shí)，就需要選擇一種簡(jiǎn)便、快捷的篩選方法。熒光光譜測(cè)定法能通過檢測(cè)與CPPs結(jié)合的熒光基團(tuán)來對(duì)被細(xì)胞攝取的多肽分子進(jìn)行定量分析，在分析前用中濃度的胰蛋白酶洗脫孵育時(shí)結(jié)合在細(xì)胞表面的熒光基團(tuán)，通過比較細(xì)胞裂解釋放的熒光和溶液中的熒光可以確定被細(xì)胞攝取的CPPs的摩爾數(shù)，再進(jìn)一步通過量化蛋白量確定CPPs的穿膜。這個(gè)方法十分快捷，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)同時(shí)比較幾種甚至十幾種CPPs，并且此技術(shù)較經(jīng)濟(jì)，是一種比較理想的用于CPPs初篩的方法。此外，若使用熒光光譜測(cè)定法檢測(cè)多肽分子的不同攝取通路時(shí)，加入不同攝取通路的相關(guān)抑制劑即可獲得CPPs的穿膜途徑的相關(guān)資料。如Lundin等檢測(cè)了7種CPPs的入胞途徑，包括陽離子CPPs（M918、penetratin、TAT）和兩親性CPPs（TP、TP10、MAP、pVEC），結(jié)果顯示兩類CPPs是通過不同的途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的[12]。

2電子顯微鏡

電子顯微鏡較之普通光學(xué)顯微鏡在細(xì)胞水平上有更高的分辨率，成像更清晰；共聚焦顯微鏡依賴熒光，而不同的熒光基團(tuán)在不同細(xì)胞器的淬滅時(shí)間不同，與電子顯微鏡相比容易影響多肽分子亞細(xì)胞定位的準(zhǔn)確性，如Saalik等對(duì)TP及TP10的入胞途徑進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察時(shí)，大約有20%的CPPs與脂筏途徑標(biāo)記物發(fā)生了共定位，而電子顯微鏡彌補(bǔ)了這一缺陷[14]。雖然電子顯微鏡提供了最高的分辨率，并能更好地對(duì)入胞后的CPPs進(jìn)行定位，但電子顯微鏡價(jià)格昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室沒有這個(gè)設(shè)備且樣本的制作需要一定的經(jīng)驗(yàn)[13，14]，因而不是十分經(jīng)濟(jì)便利（表1）。

3質(zhì)譜分析

阻礙多肽分子作為體內(nèi)藥物遞送載體的最大因素是其在血清內(nèi)的快速降解，唯一可顯示多肽分子的降解并分辨多肽分子的降解產(chǎn)物的方法是質(zhì)譜分析法（massspectrometry，MS）。然而，樣品中存在的血清會(huì)導(dǎo)致高背景與低信號(hào)噪聲比.可通過使用ZipTips○R（Millipore）克服這一難題。ZipTips是一個(gè)含有層析介質(zhì)床的無固定死腔的10μL槍頭，可有效收集純化曝光液或細(xì)胞裂解液中的多肽分子。如Elmquist等將疏水性多肽pVEC（protein frommurinevascularendothelialcadherin）與ZipTips上的層析介質(zhì)結(jié)合以收集樣品，再通過MS進(jìn)行分析，結(jié)果顯示pVEC在含有10個(gè)單位的胰蛋白酶的PBS緩沖液中的半衰期是10.5min，在含有4.2個(gè)單位羧肽酶A及1.8個(gè)單位羧肽酶B的PBS緩沖液中的半衰期是44.6min[15]。Burlina等利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laserdesorption/ionizationtimeof flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）分析法定量測(cè)定penetratin，（Arg）9及TAT48-59時(shí)，通過ZipTips收集純化細(xì)胞裂解液中生物素化的CPPs及內(nèi)參。CPPs與靶細(xì)胞孵育后，用胰蛋白酶消化膜上的多肽分子，并在細(xì)胞裂解時(shí)，引入內(nèi)參以監(jiān)控多肽分子在制樣時(shí)的降解[16]，MS不僅能夠定量測(cè)定一個(gè)CPP的攝取與降解，還可用于分子質(zhì)量不同的CPPs混合物的測(cè)定。由此可見，這是一個(gè)高效的檢測(cè)CPPs穿膜的方法，但值得注意的是，由于許多洗脫步驟都不允許多樣品上樣，且許多疏水性多肽分子在上樣之前可能發(fā)生丟失，易影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性（表1）：

4生物效應(yīng)

CPPs被定義為經(jīng)典的運(yùn)載工具，這意味著它們可被廣泛應(yīng)用于不同貨物的運(yùn)輸。雖然熒光分析技術(shù)可高效地用于新CPPs的初篩，但最近大量研究都表明熒光的吸收會(huì)產(chǎn)生不可避免的生物應(yīng)答，如熒光標(biāo)記的寡核苷酸或其類似物如肽核酸（PNA）與CPPs結(jié)合入胞后可引起劇烈的生物反應(yīng)，因而考慮生物效應(yīng)的分析方法是更佳的選擇[12、17-20]（表1）。

4.1鏈接校正

使用鏈接校正寡核稈酸（SCOS）來評(píng)估CPPs遞送貨物的能力是近幾年十分常見的研究手段，此方法最初由Kole等于1998年建立。HeLapluc705細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染熒光素酶，報(bào)告基因被含有一個(gè)異常剪接位點(diǎn)的來自β-珠蛋白的前體mRNA打斷，異常剪接位點(diǎn)激活潛在的剪接位點(diǎn)，在正常情況下會(huì)產(chǎn)生非功能性的熒光素酶；若引入SCOS互補(bǔ)綁定異常剪接位點(diǎn)，剪接后則會(huì)產(chǎn)生功能性熒光素酶。因而可通過結(jié)合不同的CPPs到潛在剪接位點(diǎn)的互補(bǔ)SCOS，評(píng)估CPPs作為藥物載體的能力[21]。如Lehto等通過鏈接校正技術(shù)對(duì)硬脂酰改造的（RxR）（4）進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，該CPP具有強(qiáng)大的運(yùn)載貨物的能力[20]。由于剪接發(fā)生在核內(nèi)，這種分析手段可給出SCOS在胞內(nèi)的分布情況及CPP-SCOS復(fù)合體是否發(fā)生內(nèi)囊泡逃逸等相關(guān)信息，是一種優(yōu)于熒光分析技術(shù)的檢測(cè)手段[22]。但是鏈接校正技術(shù)需要特殊的細(xì)胞系HeLapLuc705，且該檢測(cè)依賴于熒光素酶底物的發(fā)光，不是十分經(jīng)濟(jì)。

4.2Cre-重組酶

基于Cre-loxP系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)是另一個(gè)比較理想的用于確定CPPs攜帶貨物能力的方法。這是目前國(guó)內(nèi)外研究和應(yīng)用比較廣泛的一種位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，主要包含兩個(gè)部分：一個(gè)是loxP位點(diǎn)，另一個(gè)是識(shí)別loxP位點(diǎn)的Cre-重組酶。Cre-重組酶是一種無須輔助因子便能催化loxP位點(diǎn)之間的DNA特殊位點(diǎn)重組的拓?fù)洚悩?gòu)酶。Wadia等將Cre-loxP系統(tǒng)用于CPPs轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白入胞的檢測(cè)，TAT-Cre蛋白被轉(zhuǎn)導(dǎo)到包含loxP-STOP-loxP的增強(qiáng)型綠色熒光蛋內(nèi)基因（enhancedgreeniluorescentprotein，EGFP）的小鼠T細(xì)胞中，Cre-重組酶切除了STOP片段從而抑制了EGFP的表達(dá)，因其非特異性毒性且不干擾結(jié)果，具有明顯的優(yōu)勢(shì)[23]。此技術(shù)雖然特異性非常強(qiáng)，但它依賴于CPP-Cre的表達(dá)，相當(dāng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力且很難取得足夠的蛋白量，因而未得到普及。此外，Cre-重組酶是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量相當(dāng)大的貨物，會(huì)影響CPPs的性狀。

4.3凋亡與增殖

絕大多數(shù)CPPs的潛在用途是作為載體運(yùn)輸藥物到人或動(dòng)物，而CPPs在癌癥領(lǐng)域的應(yīng)用主要是為了增加細(xì)胞凋亡以減少細(xì)胞增殖，如Aroui等研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖的同時(shí)可引起抑制凋亡的原癌基因Bcl-2的過表達(dá)，從而阻礙細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而利用CPP運(yùn)送阿霉索在有效阻礙MDA-MB231乳腺癌細(xì)胞的增殖同時(shí)，可驅(qū)動(dòng)其他的細(xì)胞凋亡途徑[24]。雖然CPRs已被成功用于癌癥治療中化療藥物的運(yùn)送載體，但新的研究發(fā)現(xiàn)這種應(yīng)用還有繼續(xù)改良的空間，利用此方法的主要目的是監(jiān)控阻止腫瘤細(xì)胞增殖，但大量的研究發(fā)現(xiàn)CPPs的非特異性非細(xì)胞毒性可能會(huì)對(duì)治療效果發(fā)生干擾，而不能體現(xiàn)運(yùn)送的貨物的相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)[24]。

迄今為止，有許多不同的方法可用于評(píng)估CPPs的入胞能力，但單一的檢測(cè)技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，不能確切地證實(shí)CPPS的入胞能力。建議結(jié)合使用幾種方法，以彌補(bǔ)各檢測(cè)手段的缺陷，防止假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

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