程雙懷， 金思宇， 陳款民， 孫道琴， 魏世祥， 項賢領(lǐng)

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院、安徽省高校生物環(huán)境與生態(tài)安全省級重點實驗室、重要生物資源保護和利用研究安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241000)

十種臂尾輪蟲12S rDNA基因序列的PCR擴增及分析

程雙懷， 金思宇， 陳款民， 孫道琴， 魏世祥， 項賢領(lǐng)

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院、安徽省高校生物環(huán)境與生態(tài)安全省級重點實驗室、重要生物資源保護和利用研究安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241000)

通過對角突臂尾輪蟲、尾突臂尾輪蟲、裂足臂尾輪蟲、剪形臂尾輪蟲、方形臂尾輪蟲、壺狀臂尾輪蟲、紅臂尾輪蟲、鐮形臂尾輪蟲、萼花臂尾輪蟲和十指臂尾輪蟲等十種臂尾輪蟲和矩形龜甲輪蟲的12S rDNA基因進(jìn)行擴增和序列測序，結(jié)合Genbank中兩種褶皺臂尾輪蟲的125rDNA序列，使用MEGA軟件構(gòu)建這13種輪蟲系統(tǒng)發(fā)生樹(NJ樹)，探討了12種臂尾輪蟲之間的系統(tǒng)關(guān)系.結(jié)果表明：本研究所涉及的輪蟲12S rDNA序列差異百分比均值為34.41%，可作為分子標(biāo)記應(yīng)用于輪蟲屬內(nèi)種間系統(tǒng)關(guān)系研究；系統(tǒng)樹支持將十指臂尾輪蟲、裂足臂尾輪蟲歸屬于臂尾輪屬；壺狀臂尾輪蟲和紅臂尾輪蟲是兩個獨立的種.

輪蟲；臂尾輪屬；12S rDNA；系統(tǒng)發(fā)生

輪蟲隸屬輪蟲動物門(Rotifera)，約2000多種.早期的輪蟲分類及系統(tǒng)關(guān)系研究主要依據(jù)輪蟲的形態(tài)學(xué)特征.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和DNA測序費用的降低，分子分析手段被逐漸應(yīng)用到輪蟲的分類和系統(tǒng)關(guān)系研究中.12S rDNA為線粒體核糖體小亞基rRNA的編碼序列.12S rDNA序列比較保守，但也具有變異區(qū)域，可以用于屬內(nèi)種間或種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究，也可以用于種或地理品系的鑒定.作為分子標(biāo)記，12S rDNA已經(jīng)被廣泛用于一些物種的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究中[1-3].

臂尾輪屬隸屬于臂尾輪科，屬中許多種類廣泛分布于各類水體，大多數(shù)為優(yōu)勢種.本屬目前已發(fā)現(xiàn)34種，我國已記載的有10多種，但常見的不到10種[4].屬中壺狀臂尾輪蟲(B.urceolaris)、紅臂尾輪蟲(B.rubens)、十指臂尾輪蟲(B.patulus)、裂足臂尾輪蟲(B.diversicornis)和褶皺臂尾輪蟲(B.plicatilis)等在種類劃分和系統(tǒng)發(fā)生上一直存有爭議[5-10].本研究擴增并測定臂尾輪屬十個常見種類的12SrDNA部分序列，通過建立系統(tǒng)樹探討臂尾輪蟲的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，試圖解決一些傳統(tǒng)分類學(xué)上的爭議和物種的分類地位問題；也為輪蟲大規(guī)模培養(yǎng)時，物種的分子鑒定提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

研究用角突臂尾輪蟲(B.angularis)、尾突臂尾輪蟲(B.caudatus)、裂足臂尾輪蟲、剪形臂尾輪蟲(B.forficula)、方形臂尾輪蟲(B.quadridentatus)、壺狀臂尾輪蟲、紅臂尾輪蟲、鐮形臂尾輪蟲(B.falcatus)、萼花臂尾輪蟲(B.calyciflorus)、十指臂尾輪蟲和矩形龜甲輪蟲(Keratellaquadrata)分別采自蕪湖市鏡湖、汀棠湖、鳳鳴湖和蓮塘等水體(表1).除裂足臂尾輪蟲以外的9種臂尾輪蟲和晶囊輪蟲采集后于實驗室內(nèi)在25±1℃、自然光照(光照強度約130lx，L∶D=14∶10)條件下進(jìn)行“克隆”培養(yǎng).輪蟲培養(yǎng)液采用[11]配方(pH=7.3)，臂尾輪蟲以HB-4培養(yǎng)基[4]培養(yǎng)的、處于指數(shù)增長期的斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)為餌料，晶囊輪蟲用角突臂尾輪蟲為餌料，當(dāng)各“克隆”輪蟲的個體數(shù)達(dá)100只以上時用輪蟲培養(yǎng)液過濾沖洗，饑餓72h后用滅菌雙蒸水沖洗，Eppendorf管收集，-20℃保存?zhèn)溆?裂足臂尾輪蟲難以培養(yǎng)，直接從野外水體中采集、挑取并純化，經(jīng)上述方法處理后-20℃保存?zhèn)溆?

1.2 總DNA提取

用玻璃粉法提取基因組DNA[12].具體方法為：離心獲得輪蟲樣品，ddH2O沖洗2次，置1.5ml Eppendorf管中，加500μl DNA提取緩沖液(0.5%SDS，25mM EDTA，25mmol/L NaCl，100mmol/L Tris-HCl，pH8.0)和20μl 蛋白酶K(20μg/ml)，置60℃水浴2h；加500μl 8M預(yù)熱后的硫氰酸胍和40μl(1∶1)的潔凈玻璃粉乳液，混勻后置37℃水浴1h，不時搖動；取出，4000rpm離心2min，棄去上清液；沉淀用70%冰乙醇洗2次，再用丙酮洗1次；置真空干燥機中干燥.加TE(pH8.0)40μl，置56℃水浴30min，取出，8000rpm離心2min，吸上清液，置-20℃保存?zhèn)溆?

1.3 PCR擴增及序列測定

表1 13個樣本的核苷酸序列來源Table 1 The origins of nucleotide sequences of 13 samples

擴增反應(yīng)在MJ Research 公司生產(chǎn)的PTC-100TM擴增儀上進(jìn)行.參照已經(jīng)報道的褶皺臂尾輪蟲線粒體全序列設(shè)計合成PCR引物：Br12S F：CACAAAAGACAAGGATTAG； Br12S P：GTAACAGAGGTGACGGGATTTGTAC，于上海Invitrogen公司合成.其他試劑均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司.PCR反應(yīng)體系的總體積為25μl，包括1×Buffer，0.2mmol/L dNTP，1.5μmol/L引物，2mmol/L Mg2+，DNA模板2μl，1U的Taq酶，超純水補至25μl.擴增反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，53℃退火1.5min，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存10h，終止反應(yīng).擴增完成后，PCR產(chǎn)物用乙醇沉淀或DPS系統(tǒng)純化，沉淀涼干后加適量TE溶解，取2μl 于1%的瓊脂糖凝膠電泳上檢查，其余-20℃保存?zhèn)溆?將純化產(chǎn)物與質(zhì)粒載體連接，質(zhì)粒載體為pMD 18-T vector，按《分子克隆實驗指南(第2版)》[13]進(jìn)行操作.用Qiagen公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取所要的克隆子質(zhì)粒DNA，ABI PRISM 377型自動測序儀進(jìn)行序列測定.

1.3 系統(tǒng)發(fā)生分析

對測序結(jié)果進(jìn)行處理并分析，序列編輯使用CLUSTAL X(1.81)軟件[14]進(jìn)行DNA序列比對；用DNASTAR軟件計算兩兩序列的序列差異百分比；再用DnaSP 3.5軟件[15]分析變異位點；用MEGA(version 3.1)軟件計算不同序列間轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)；采用DAMBE軟件進(jìn)行基因替換的飽和性分析.用鄰接法(neighbor-joining method，NJ)重建系統(tǒng)發(fā)生樹.NJ樹構(gòu)建使用MEGA軟件，采用P-distance距離模型；系統(tǒng)樹各結(jié)點的支持率以序列數(shù)據(jù)集100次重復(fù)抽樣檢驗的自引導(dǎo)值(bootstrap value)表示.

2 結(jié)果

對本文測序的13個輪蟲樣品12S rDNA核苷酸序列分析顯示，已測定的各種輪蟲12S rDNA序列長度并不一致，最長的為矩形龜甲輪蟲(475bp)，最短的是壺狀臂尾輪蟲(332bp).12S rDNA基因序列中，A、C、G、T堿基的平均含量分別為 31.0%、 13.1%、 17.2%和38.7%，其中A+T含量(69.7%)較豐富，明顯大于C+G含量(30.3%).經(jīng)比對，339個位點中共有86個保守位點，占25.4%；251個變異位點(表2)，占74.0%；單一位點114個，簡約信息位點135個.用MEGA(version3.1)軟件分析堿基的轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)，轉(zhuǎn)換與顛換之比平均為0.928.用DNASTAR軟件分析發(fā)現(xiàn)序列差異百分比最大值為79.8，最小值為2.5，平均值為34.41(表3).從遺傳距離及轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)散點飽和圖(圖1)中可以看出，顛換數(shù)高于轉(zhuǎn)換數(shù)，隨著遺傳距離的增加，轉(zhuǎn)換和顛換數(shù)均伴有線性增加，未出現(xiàn)飽和現(xiàn)象.

2.3 系統(tǒng)發(fā)生樹

根據(jù)所測序列用MEGA分析軟件，基于P-distance距離模型，以矩形龜甲輪蟲為外群，采用鄰接法(NJ法)構(gòu)建了13個樣品的系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2)，樹節(jié)點支持率較高.

表2 13個樣本12S rDNA基因的部分核苷酸序列變異位點Table 2 Variable sites of partical 12S rDNA nucleotide sequences in thirteen samples

續(xù)表2

物種名稱序 列222222222222222222222222222222222222233333333333333333333333335555556666666666777777788888999999999000001111111112222223333345678901234567890123469135890123567890123601234678901246835678B．a(chǎn)ngularisTTAGTTTACTACTTAATTCGGTGAGATATTTTGTTTATATAGTTCCTCTCTTTAGAA?CCGTB．calyciflorus．C．A．A．TAG?．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．C．．AA．．．．．．．C．TCT．TC．．．．．．CGTACB．caudatusCC．AAA．TAGG．．．．．．．．．．．．．．．．．?．．CA．AA．．．．．A．．TA．T．TC．．．．．．?．．．．B．diversicornis．．TA．．．．AA．T．．T．．．．C．AT．AT．T．．．．TAA．T．．?．T．．．．．T．T．．．TATC?．．C．B．falcatusA．．T．AC．AA．．．．．．．CT．．CA．．．CT．．．A．．AC．．．AG．．．TGCT．TC．．．．．．CGTACB．forficulaA．．T．AC．AA．．．．．．．CT．．CA．．．CT．．．A．．AC．．．AG．．．TGCT．TC．．．．．．G．．．．B．koreanus．．．A．ACGGA?TC．．．．．T．．．A．．．．G?．．．．．．AG．．C．．．CA．ATCT．C．．．．．G．．．．B．patulus．．．A．A．．AG?TC．．．．．T．．．．T．．．．．．．A．．A．G．．．G．．．．TCTCT．．．．．．．?．．．．B．plicatilis．．．AAA．．GG?．．．．．．．T．．．．．．．．G．．．G．．AAGC．C．．C．TTA．．．．C．．．．．G．．．．B．quadridentatus．．．．．A．GAG?T．．．．．．T．．．．．．．．．．．．G．．AA．．．．．．．CT．CT．TC．．．．．．G．．．．B．rubens．．．A．．C．AG?．C．．．．．T．．．．．．．C．C．．．．．AA．．G．G．．GATCT．T．．．．．．．G．．．．B．urceolaris．．．A．AA．AA?TC．．．．．T．．．．．．．．．．．．G．．AAG．．．T．．CTACT．TC．．．．．．?．．．．K．quadrata．．．AAAAT．A?GCC．TCAA．AC．．．．C?．CC．．．．．C．GGG．．CATC．．T．CCT．．．?．．．．

表3 13個樣品12S rDNA基因序列轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)(對角線上)及差異百分比(對角線下)Table 3 Numbers of transitions/transvertions (above diagonal) and percentage of divergence (below diagonal) for 12S rDNA gene sequences in 13 samples

3 討論

本研究中，輪蟲13個樣品的12S rDNA基因序列之間差異百分比最大值為79.8，最小值為2.5，平均值為34.41，因此12S rDNA基因序列可以作為分子標(biāo)記應(yīng)用于臂尾輪蟲的分子分類和分子系統(tǒng)進(jìn)化研究.基于12S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹能夠反映臂尾輪蟲種間的親緣關(guān)系.方形臂尾輪蟲和壺狀臂尾輪蟲都是附著型生活方式，在構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹中它們構(gòu)成單系群.鐮形臂尾輪蟲和剪形臂尾輪蟲都具有“八字形”后棘刺，NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹中它們也構(gòu)成單系群，說明兩個物種的親緣關(guān)系較近.在臂尾輪蟲之間的12S rDNA序列差異百分比中，鐮形臂尾輪蟲和剪形臂尾輪蟲為最小值為2.5，同樣支持上述結(jié)論.此結(jié)果與Xiang等[16]利用ITS序列、程雙懷等[17，18]利用COⅠ序列、28S rDNA所得出的研究結(jié)果基本一致.

Turner[7]和Segers等[8]通過分析比較平甲輪屬(Platyias)、臂尾輪屬和十指臂尾輪蟲咀嚼器的超微結(jié)構(gòu)，將十指臂尾輪蟲立為一個新屬——扁甲輪屬(Plationus)，而傳統(tǒng)的分類學(xué)方法將它置于臂尾輪屬中[19-21].本研究構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹中十指臂尾輪蟲和方形臂尾輪蟲與壺狀臂尾輪蟲聚在一起，而且結(jié)點自展檢驗值較高，為82，由此推斷十指臂尾輪蟲應(yīng)隸屬于臂尾輪屬，且與方形臂尾輪蟲和壺狀臂尾輪蟲的親緣關(guān)系最近，此結(jié)果與Xiang[16]等利用ITS序列、程雙懷[17，18]等利用線粒體基因COⅠ序列、核基因28SrDNA得出的研究結(jié)果不同，而與程雙懷[22]等利用16SrDNA以及Wulfert和Koste應(yīng)用傳統(tǒng)的分類學(xué)方法所得到的研究結(jié)果一致，不支持Turner[7]和Segers等[8]將它另立新屬的觀點.因此十指臂尾輪蟲的分類地位在分子水平的分析結(jié)果也不一致，需要更多的數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究.

壺狀臂尾輪蟲和紅臂尾輪蟲具有相似的形態(tài)，早期的研究曾將這二者歸為一種，稱為B.urceus，也譯為壺狀臂尾輪蟲[5]；后來Koste[20]、章宗涉和黃祥飛[4]根據(jù)蟲體前端棘刺的兩側(cè)是否對稱和眼點的形狀不同把B.urceus分為B.urceolaris和B.rubens兩種.在本研究中，壺狀臂尾輪蟲和紅臂尾輪蟲12SrDNA基因序列差異百分比高達(dá)16.7%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于鐮形臂尾輪蟲和剪形臂尾輪蟲之間序列差異百分比(2.5%)，因此可以判斷兩者應(yīng)分別為獨立的、不同的種.此結(jié)論支持程雙懷等利用COⅠ序列[17]、28SrDNA[18]和16SrDNA[22]研究的結(jié)果.

裂足臂尾輪蟲具有臂尾輪屬的一些顯著特征，所以有的輪蟲學(xué)家將它歸屬于臂尾輪屬[20，4].但是它的形態(tài)又具有特殊性，如它的被甲比較長，即使不包括兩端的棘刺在內(nèi)，長度也大于寬度.王家楫[5]依據(jù)它的足的結(jié)構(gòu)與其他臂尾輪蟲不同，將它另立一屬——裂足輪屬(Schizocerca).本研究中系統(tǒng)樹支持裂足臂尾輪蟲隸屬于臂尾輪屬.此結(jié)果支持鮑蕾等[6]和程雙懷等利用COⅠ[20]、利用28SrDNA[18]和16SrDNA[22]研究的結(jié)果.

在構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，海產(chǎn)的褶皺臂尾輪蟲位于淡水臂尾輪蟲之間，支持海產(chǎn)輪蟲來源于淡水輪蟲，但結(jié)點自展檢驗值較低，可能是由于所用序列較短.因此，關(guān)于海產(chǎn)輪蟲的起源與演化需要進(jìn)一步研究.

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PCR Amplication and Sequence Analysis of Partial 12S rDNA Gene From TenBrachionusSpecies (Rotifera)

CHENG Shuang-huai, JIN Si-yu, CHEN Kuan-min, SUN Dao-qin, WEI Shi-xiang， XIANG Xian-ling

(College of Lofe Sciences, Provincial Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui, Anhui Provincial Key Lab of the Conservation and Exploitation of Biological Resources, Anhui Normal University, Wuhu 241000， China)

Partial sequences of 12S rDNA gene fromBrachionusangularis,B.caudatus,B.diversicornis,B.forficula,B.quadridentatus,B.urceolaris,B.rubens,B.falcatus,B.calyciflorus,B.patulusandKeratellaquadratawereamplifiedandsequenced.Combinedwith12srDNAofB.plicatilisandB.koreanusfromGenbank,phylogenetictreewerebuiltbasedonneighbor-joining(NJ)methodwithMEGAsoftware,aimingtorevealtheirphylogeneticrelationshipsandresolvesometaxonomicissues.Theresultsshowedthatthepercentageofdivergencefor12SrDNAgenesequencesin13sampleswasaveraged34.41%.Thus,the12SrDNAgenewassuitableforexploringthephylogenyandevolutioninrotifera.TheNJtreesupportedthatB.patulusandB.diversicornisbelongtothegenusBrachionus,whileB.urceolarisandB.rubensaretwopotentialspecies.

rotifera;Brachionus; 12SrDNA;phylogeny

10.14182/J.cnki.1001-2443.2015.05.011

2015-05-25

國家自然科學(xué)基金(31200324)；安徽省自然科學(xué)基金(1208085QC47)；國家級大學(xué)生校外實踐教育基地大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目.

程雙懷(1973-)，男，安徽懷寧人，副教授，博士，主要研究方向：輪蟲分子生物學(xué).

程雙懷，金思宇，陳款民，等.十種臂尾輪蟲125rDNA基因序列的PCR擴增及分析[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2015，38(5)：460-465.

Q951.3

A

1001-2443(2015)05-0460-06