張鵬飛，劉永萱，張亞利，馬志坤，梁 碩，馮笑山

Rictor在賁門癌組織中的表達及臨床意義

張鵬飛，劉永萱，張亞利，馬志坤，梁 碩，馮笑山

目的 檢測Rictor在賁門癌及相應癌旁正常組織中的表達差異，分析其與賁門癌臨床病理之間及預后的關系，判斷其作為賁門癌早期診斷及預后指標的可能性。方法 采用熒光定量PCR方法、免疫組織化學S-P法檢測Rictor在30例賁門癌組織及相應癌旁正常組織中的表達情況。結果 賁門癌癌旁組織中Rictor基因拷貝數(shù)為9.10×108～11.12×109，賁門癌組織中為7.78×105～8.58×106；Rictor在賁門癌組織及相應癌旁正常組織中的陽性表達率分別為 56.7%(17/30)、76.7%(23/30)，統(tǒng)計學處理有顯著性差異(P<0.05)。Rictor在賁門癌組織中表達降低與患者的年齡、性別、TNM分期及淋巴結轉移均無關(P>0.05)，與腫瘤分化程度相關(P<0.05)。結論 Rictor在賁門癌旁組織中的表達明顯高于賁門癌組織中的表達，初步推斷該基因的表達與癌癥進程相關，有可能成為賁門癌早期診斷、治療以及預測賁門癌患者預后的具有重要應用價值的指標。

賁門癌；Rictor；熒光定量PCR；免疫組織化學

賁門癌(Gastric cardia adenocarcinoma, GCA)是指發(fā)生于賁門黏膜上皮以及賁門腺體的惡性腫瘤，是迄今為止嚴重危害人類生命和健康的疾病之一，具有高發(fā)病率和死亡率的特點。其病灶原發(fā)于或中心位于食管胃黏膜交界線向下2 cm范圍，主要類型為腺癌。Rictor (rapamycin-insensitive companion of mTOR)為mTOR復合物2(mTORC2) 中一個新確定的蛋白成員，是雷帕霉素不敏感復合物mTORC2的特征性支架蛋白，與 mTOR、mSin1 和 Protor 四者一起組成mTORC2，Rictor缺失會使mTOR無法發(fā)揮其激酶活性。Rictor作為mTORC2復合物中的一員，在腫瘤增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT) 等過程中發(fā)揮著重要作用。本研究欲通過熒光定量PCR和免疫組化的方法檢測賁門癌組織及相應癌旁組織中Rictor的表達情況，探討Rictor與賁門癌發(fā)生發(fā)展和臨床病理特征的關系，旨在為探索新的病原監(jiān)測和癌癥風險評估方法提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗標本 收集2012年2月至2013年10月由河南科技大學第一附屬醫(yī)院確診并行賁門癌根治術的原發(fā)性賁門癌組織及其相應癌旁正常組織(距癌組織5 cm以上)標本各30例，所有術前病例未經(jīng)放療和化療。男22例，女8例；年齡42-79歲：≤60歲 14例， >60 歲16例；高分化9例，中分化14例，低分化7例；侵及黏膜下層及以下0例，肌層3例，外膜及以上27例；淋巴結轉移陽性24例，陰性6例。

1.1.2 主要試劑 PrimeScript II逆轉錄酶試劑盒，通用型DNA純化回收試劑盒，質粒小提試劑盒均購自天根公司，鼠抗人Rictor單克隆抗體，購自美國Santa Cruze公司，即用型SP超敏免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術有限公司。

1.2 熒光定量PCR法

1.2.1 樣本總RNA的制備 將賁門癌及相應賁門癌癌旁組織用研缽在液氮下碾碎，加入500 μL DMEM培養(yǎng)基重懸，于4 ℃ 8 000 r/min離心4 min，取上清300 μL至1.5 mL離心管中；加入500 μL TRIzol試劑，輕柔上下顛倒混勻2～3 min；加入170 μL三氯甲烷，劇烈上下顛倒震蕩3 min后，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；取500 μL上清液至一支新的1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇后震蕩混勻1 min，室溫放置10 min后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；棄去管內上清液，加入600 μL 75%酒精，上下顛倒混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心4 min；棄去上清，將離心管置于超凈臺內室溫風干15 min后，加入35 μL經(jīng)DEPC處理的高壓滅菌蒸餾水溶解沉淀，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA第一鏈合成 參照PrimeScript II逆轉錄酶試劑盒使用說明書對所抽提的樣品總RNA進行反轉錄，操作步驟如下：使用Oligo dT Primer(50 μM)進行cDNA第一鏈的合成。在PCR管中依次加入5 μL模板RNA，1 μLdNTP Mixture(10 mM each)，1 μL Oligo dT Primer，加RNase Free dH2O補足至10 μL，輕柔混勻；65 ℃水浴5 min后，迅速置于冰上冷卻；在上述混合溶液中依次加入4 μL 5×PrimeScript II Buffer，1 μL PrimeScript II RTase(200 U/μL)，0.5 μL RNase Inhibitor(40 U/μL)，加入RNase Free dH2O補足至20 μL，輕柔混勻；逆轉錄反應程序為：42 ℃ 60 min，之后95 ℃ 5 min，用以滅活PrimeScript RTase；用超微量紫外-可見光分光光度計測定所獲得的cDNA的純度和濃度，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Rictor基因引物的合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫已發(fā)表的Rictor基因序列，利用Primer Express 2.0軟件設計并合成用于檢測Rictor基因的引物，序列見表1。引物序列經(jīng)BLAST檢索驗證，均具有很強的特異性。以之前實驗所獲得的cDNA為模板，對Rictor基因進行PCR擴增。PCR反應總體系為50 μL：100 ng模板cDNA，5 μL 10×PCR buffer，4 μL10 mmol/L dNTP混合物，rTaq DNA聚合酶2.5 U，上、下游引物各10 pmol，加RNase Free dH2O補足至50 μL。PCR反應程序為預變性溫度及時間95℃，10 min，變性溫度及時間 95℃，15 s，退火溫度及時間60℃,1min，延伸溫度及時間72℃，20 s，循環(huán)數(shù)40,最后延伸溫度及時間72℃，10 min。

表1 定量PCR檢測Rictor基因引物

1.2.4 實時定量PCR檢測Rictor基因拷貝數(shù) 對樣品進行實時定量PCR測定的反應體系和反應條件同上，分別對從30例新鮮賁門癌組織和30例賁門癌癌旁組織中獲得的cDNA樣品進行檢測，同時設不加模板的陰性對照(NTC)和食管癌細胞系TE-1 KYSE細胞獲得的cDNA模板為陽性對照。根據(jù)測得的Ct值與標準曲線得到樣品中Rictor基因拷貝數(shù)，其與相應組織樣品重量(μg)的比值即為單位重量組織中Rictor基因的拷貝數(shù)。

1.3 免疫組化法 標本在10%福爾馬林液中固定后用石蠟包埋，再連續(xù)厚度4 μm切片，石蠟切片然后脫蠟，在高溫pH 9.0 EDTA抗原修復處理液中完全修復6 min，取出自然降至常溫，內源性過氧化物酶以3%的H2O2滅活，再用一抗二抗作用后，在DAB顯色且在光鏡下控制呈色，后用蘇木素復染脫色，最后中性樹膠封片。

結果判定標準 結果判定采用雙盲法，并有兩位病理科醫(yī)師獨立觀察每張切片后一起作出判定，用低倍鏡和高倍鏡觀察切片，判斷陽性反應標準根據(jù)以下兩個方面：①按切片中顯色癌細胞數(shù)比例計分，陽性細胞數(shù)<25%為0，25%～50%為1，51%～75%為2，>75%為3。②按切片中癌細胞顯色強度計分：染色強度計分無染色為0，淡黃色為1，黃色為2，深黃色為3。A+B>3分記為陽性，≤3分記為陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理 關于熒光定量PCR實驗結果運用SAS 8.2統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，用方差齊性檢驗和正態(tài)分布檢驗對數(shù)據(jù)進行驗證，使用Wilcoxon秩和檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。關于免疫組化結果運用分類資料的比較χ2檢驗和Fisher′s確切概率法，用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，以P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PCR產物鑒定 Rictor基因標準品的PCR擴增產物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得大小為211 bp的條帶，與預期結果相符，且無非特異性條帶產生(圖1)。樣本Rictor基因拷貝數(shù)的測定:取各樣品cDNA 50～100 ng，以此為模板用定量PCR檢測Rictor基因，根據(jù)Ct值和標準曲線計算Rictor基因的拷貝數(shù)。每組數(shù)據(jù)均呈偏態(tài)分布，其中賁門癌組織Rictor基因拷貝數(shù)為7.78×105至8.58×106之間，賁門癌癌旁組織為9.10×108至11.12×109之間，統(tǒng)計學分析結果為P<0.01，表明賁門癌組織Rictor基因拷貝數(shù)與賁門癌癌旁正常組織中Rictor基因拷貝數(shù)有顯著差異，Rictor基因拷貝數(shù)在賁門癌癌旁正常組織中顯著增高。

圖1 Rictor標準品質粒PCR檢測結果

注：M：DNA 標準 DL 100；1-6：梯度稀釋的標準品質粒；7：陰性對照。

2.2 Rictor蛋白在賁門癌組織中的表達 Rictor在賁門癌組織及相應癌旁正常組織中的陽性表達率分別為 56.7%(17/30)、76.7%(23/30)，統(tǒng)計學處理有顯著性差異(P<0.01)。賁門癌組織中Rictor蛋白的表達顯著低于其在相應癌旁正常組織中的表達(P<0.01)，見表2。免疫組化染色結果顯示，在賁門癌癌旁正常組織細胞質中Rictor蛋白染色為棕褐色；而在賁門癌組織石蠟切片中，Rictor蛋白多數(shù)呈棕黃色，棕褐色染色部分較少。2組樣品中Rictor蛋白表達具有統(tǒng)計學差異，且在賁門癌癌旁正常組織中Rictor的表達明顯增強,P<0.100(圖2)。

表2 Rictor在賁門癌組織及相應癌旁正常組織中的表達 例(%)

注：P<0.01。

A 賁門癌Rictor胞漿表達如箭頭所示(SP,×400)

B 賁門癌癌旁Rictor胞漿表達如箭頭所示(SP,×400)

2.3 Rictor表達與臨床病理參數(shù)之間的相關性 見表3。

表3 Rictor表達與臨床資料之間的相關性

注：Rictor表達與年齡、性別、TNM分級、淋巴結輕移無關，與分化程度有關。

3 討論

賁門癌發(fā)生在胃賁門部，是常見的胃腸道惡性腫瘤之一，遠處轉移是賁門癌重要的生物學特性，亦是其難以根治的主要原因[1]。我國為GCA高發(fā)區(qū)，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。從組織病理學上分析，GCA屬于腺癌，這與食管鱗癌存在顯著不同。從流行病學特征上看，GCA與胃遠側部位腫瘤具有不一致性，因此又不能簡單地歸類于胃癌[3-6]?；谏鲜鲈?，研究者們近年來將賁門癌作為一種獨立的疾病來研究，對其分子學基礎的探索也越來越重視。

Akt/PKB信號通路是細胞內信號傳導的重要環(huán)節(jié)，同時也是癌癥研究的關鍵靶標；PI3K/AKT/mTOR信號傳導通路被認為是蛋白質合成的主要信號調節(jié)通路，參與調節(jié)細胞增殖、分化、遷移等[7]，也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療與轉歸有關[8]。如乳腺癌、胃腸道間質腫瘤、肝細胞癌和非小細胞肺癌中均發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR通路的異常調控[9-10]。研究人員于1991年在酵母的突變株中發(fā)現(xiàn)并鑒定了雷帕霉素靶蛋白(Target of rapamycin, TOR)，近年來研究者們發(fā)現(xiàn)，mTOR相關的信號通路復雜且涉及面廣泛，其中多個元素的調控異常都與腫瘤的發(fā)生密切相關[11]。研究證明，mTOR存在于兩種完全不同的多蛋白復合體——雷帕霉素敏感復合體(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)和雷帕霉素不敏感復合體(mammalian target of rapamycin complex 2,mTORC2)。磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-Kinase, PI3K)的活化需要mTORC1和mTORC2的參與，前者磷酸化Akt(Thr308)位點，后者磷酸化Akt(Ser473)位點[12]。mTORC2由mTOR、mLST8、mSin1和Rictor(Rapamycin intensitive companion of mTOR)等構成[13]，是調節(jié)細胞骨架重構和細胞增殖的關鍵蛋白激酶復合體。mTORC2對Akt(Ser473)位點進行磷酸化，調控細胞生存、代謝、增殖、細胞骨架的合成等過程[14]。Rictor由1 078個氨基酸殘基組成，作為構成mTORC2的關鍵分子，通過依賴和非依賴mTOR的方式調控腫瘤細胞的細胞周期、侵襲和轉移同時也是mTORC2發(fā)揮蛋白激酶活性的關鍵蛋白[15-20]。雷帕霉素是上世紀研制出的特異性大環(huán)內酯類免疫抑制劑，如今一系列雷帕霉素類似物：CC1779、RAD001、AP23573等藥物對腎癌、乳腺癌、前列腺癌、非小細胞性肺癌有治療作用，其中雷帕霉素對由于抑癌基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)失活而導致PTEN/PI3K/AKT/mTOR信號通路激活的腫瘤效果顯著[21]。有報道顯示，Rictor在惡性膠質瘤、乳腺癌和乳頭狀腎細胞癌組織中具有高表達[22-24]，將降低Rictor基因表達后的人前列腺癌細胞注入裸鼠，發(fā)現(xiàn)其成瘤能力被抑制，且Rictor缺失的小鼠對前列腺癌的抵抗力更強[25]。本研究通過熒光定量PCR和免疫組化的方法檢測Rictor在賁門癌中的mRNA及蛋白水平表達情況，檢測結果顯示，Rictor在賁門癌組織和賁門癌癌旁組織中均有不同程度的表達，賁門癌癌旁組織的Rictor拷貝數(shù)顯著高于其在賁門癌組織中的拷貝數(shù)，Rictor在賁門癌組織中的表達率低于其在相應賁門癌旁正常組織中的表達率，本研究中免疫組化結果與熒光定量PCR方法檢測結果一致，Rictor在賁門癌組織中表達均明顯低于相應癌旁正常組織中的表達，這也與報道顯示Rictor在子宮內膜癌、前列腺癌和腎癌中表達量較低相一致[26]。另外，本研究對Rictor基因在賁門癌組織樣本中的表達情況結合各臨床資料統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，Rictor的低表達與賁門癌的分化程度有關，有待于進一步研究。加之目前學術界對Rictor調控腫瘤細胞發(fā)生和發(fā)展的機理尚未探明，所以研究Rictor調控腫瘤細胞的相關作用機制對今后開發(fā)臨床治療賁門癌的新靶點具有重要意義。

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Expressions and Clinical Significances of Rictor in Gastric Cardiac Cancer

ZHANG Peng-fei, LIU Yong-xuan, ZHANG Ya-li, et al

(First Affiliated Hospital, Henan University of Science & Technology, Luoyang 471003, China)

ObjectiveTo detect the expressions of Rictor in gastric cardiac adenocarcinoma(GCA) and corresponding adjacent normal tissues, analyze the relationship between it and clinical pathological features and prognosis of gastric cardia cancer, judge its possibility as early diagnosis and prognostic index of gastric cardia cancer.MethodsThe expressions of Rictor in 30 cases of cardiac carcinoma tissues and 30 cases of the corresponding adjacent normal tissues were measured by the fluorescent quantitative PCR method and immunohistochemistry S-P method.ResultsRictor gene copy number of adjacent tissues was 9.10×108～11.12×109. GCA was 7.78×105～8.58×106. The expression of Rictor protein in the corresponding adjacent normal tissues was 76.7%(23/30), and the GCA tissue was 56.7%(17/30). There existed significant difference between them(P<0.05). There were no significant correlations of the decreased expression of Rictor with the age,sex,TNM and lymph node metastasis(P>0.05),but tumor differentiation(P<0.05).ConclusionThe expression levels of Rictor in adjacent tissues is much higher than those in the GCA tissues (P<0.01). Preliminary inference of the expression of Rictor is related with the progression of cancer, therefore, it may be used in the early diagnosis，therapy and prognosis in GCA．

carcinoma of gastric cardia；Rictor；quantitative PCR；immunohistochemistry

2015-01-29

河南科技大學第一附屬醫(yī)院，河南洛陽 471003

張鵬飛(1988-)，男，河南平頂山人，碩士研究生，從事消化道腫瘤的基礎與臨床研究。

馮笑山，男，博士，教授，E-mail：samfeng137@hotmail.com

R735.2

A

1672-688X(2015)01-0009-05