林明 楊自力

目前認(rèn)為，促炎與抗炎反應(yīng)失衡為誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)生的根本原因，但目前對促炎與抗炎反應(yīng)失衡準(zhǔn)確評估有較大難度。大量研究表明，T輔助淋巴細(xì)胞可反映機(jī)體炎癥反應(yīng)的免疫功能狀態(tài)，其功能變化在急性肺損中的作用較大[1]。為了探討T輔助淋巴細(xì)胞的功能變化在急性肺損傷中的意義，本文選取100只小鼠作為研究對象進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)小鼠均為野生鼷鼠的變種，來源于野生的小家鼠，選取100只小鼠作為研究對象。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分成觀察組和對照組，每組50只，雌雄各半，體重20~24 g。兩組小鼠的一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 小鼠處理 首先為觀察組小鼠進(jìn)行適量脂多糖（LPS）的注射，其注射的部位主要在小鼠腹腔處，7.5 h之后再為小鼠注射適量的甲?；?苯丙氨酸，然后進(jìn)行急性肺損傷小鼠基本模型的制作，等到大約3.5 h之后將小鼠處死；對照組小鼠則進(jìn)行適量生理鹽水的簡單注射，注射的量和觀察組小鼠藥物注射量相同。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在對小鼠進(jìn)行有效處理之后，按照相關(guān)要求進(jìn)行小鼠脾細(xì)胞的正常分離，適量增添細(xì)胞培養(yǎng)液，利用顯微鏡觀察小鼠脾細(xì)胞的數(shù)量，然后對小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行稀釋處理，最終使其量控制在10×106個左右，加入適量的刀豆素，使其濃度控制在1.1 μg/mL左右，溫室溫度下及4.5%濃度的二氧化碳的環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)的時間在70 h左右，培養(yǎng)結(jié)束之后，留取細(xì)胞上清液，檢測上清液中的IFN-γ濃度及IL-4濃度，最后提取脾細(xì)胞中的RNA。

1.2.3 濃度測定 在檢測細(xì)胞當(dāng)中的相關(guān)因子濃度時，需要用到IFN-γ酶的專門吸附盒和IL-4酶的專門吸附盒，按照吸附盒上面的具體要求進(jìn)行細(xì)胞測定，利用酶標(biāo)儀對波長500 nm的位置進(jìn)行密度檢測，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的變化規(guī)律，最終確定小鼠細(xì)胞當(dāng)中的具體因子濃度。

1.2.4 基因表達(dá)數(shù)量計(jì)算 利用PCR的標(biāo)準(zhǔn)測定試劑盒，進(jìn)行小鼠脾細(xì)胞當(dāng)中的基因轉(zhuǎn)錄，使其最終合成cDNA，然后進(jìn)行PCR的有效擴(kuò)增。對引物序列進(jìn)行正常排序，主要包括IFN-γ、IL-4以及β-actin的序列引物，它們分別有各自的上游引物和下游引物。經(jīng)過對引物圖像的觀察和分析進(jìn)行產(chǎn)物測量，對三大序列產(chǎn)物進(jìn)行正常掃描，確定出具體的光密度數(shù)值，最后進(jìn)行三大序列引物光密度數(shù)值的相互對比，從而測得基因表達(dá)。

1.2.5 損傷指標(biāo)檢測 首先進(jìn)行肺組織含水量的正常檢測，在處死小鼠以后，把小鼠的右肺進(jìn)行有效割除，進(jìn)行表面水清除之后進(jìn)行肺組織稱重，稱重之后放到專門烘箱當(dāng)中進(jìn)行有效烘干后稱重；然后進(jìn)行漏出量的具體檢測，在小鼠腹腔當(dāng)中進(jìn)行藥物注射，處死小鼠之后利用專用針進(jìn)行小鼠右心室的有效穿刺，利用適當(dāng)濃度的生理鹽水進(jìn)行小鼠肺部的清洗，使其完全干凈，切除小鼠的肺部相關(guān)組織，對肺門組織進(jìn)行正常稱重，進(jìn)行小鼠肺組織的孵育，孵育的時候要添加適量的甲酰胺，收集其浸出的液體，進(jìn)行液體吸光值的具體有效計(jì)算。對照組小鼠確定伊文思藍(lán)的具體濃度值；最后進(jìn)行小鼠肺組織的有效觀察，進(jìn)行肺下葉的正常染色，觀察其病理變化情況，利用相關(guān)分析軟件確定出細(xì)胞PMN的平均值。

1.3 觀察項(xiàng)目和指標(biāo) （1）小鼠上清液中IFN-γ的含量及IL-4含量；（2）脾細(xì)胞中IFN-γ的基因表達(dá)能力[2]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組小鼠上清液中IFN-γ的含量明顯低于對照組，IL-4含量明顯高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），觀察組小鼠體內(nèi)脾細(xì)胞中IFN-γ基因表達(dá)能力明顯低于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 兩組IFN-γ、IL-4含量及IFN-γ基因表達(dá)能力比較（x-±s）

3 討論

急性肺損傷是一種各種致病因素引發(fā)的廣泛肺泡毛細(xì)血管損傷，以致炎因子釋放、中性粒細(xì)胞浸潤、廣泛肺泡毛細(xì)血管損傷為特征，臨床以難以糾正的低氧血癥及進(jìn)行性呼吸困難為主要表現(xiàn)，急性嚴(yán)重肺損傷，在臨床被定義為急性呼吸窘迫綜合征[3]。如何對肺損傷過程中肺泡受損毛細(xì)血管保護(hù)并修復(fù)，是肺保護(hù)的重點(diǎn)。ALI的發(fā)生發(fā)展，由機(jī)體過度炎癥反應(yīng)參與介導(dǎo)[4]。危重病醫(yī)學(xué)會在2001年將機(jī)體過度炎癥反應(yīng)定義為全身炎癥反應(yīng)綜合征，其后果為破壞機(jī)體自身組織。機(jī)體內(nèi)源性抗炎癥反應(yīng)伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生，呈增強(qiáng)趨勢[5]。Bone等[6]將此種抗炎癥反應(yīng)按抗炎癥反應(yīng)綜合征概括，其引發(fā)的后果是膿毒癥及免疫功能低下，故不管哪方占優(yōu)勢，ALI病發(fā)中，促炎及抗炎反應(yīng)失衡均為本質(zhì)原因。故針對檢測的促炎、抗炎反應(yīng)失衡的程度和方向，應(yīng)用不同的措施干預(yù)，使雙方動態(tài)平衡恢復(fù)，是對ALI防治的關(guān)鍵。但對促炎、抗炎雙方平衡的相關(guān)性評價，目前臨床尚無有效評估指標(biāo)。有研究顯示，Th細(xì)胞，可反映雙方平衡關(guān)系，Th1細(xì)胞以對促炎細(xì)胞因子分泌為特征，與促炎反應(yīng)有密切相關(guān)性；Th2細(xì)胞以對抗炎細(xì)胞因子分泌為特征，與抗炎反應(yīng)有密切相關(guān)性[7-9]。IFN-γ、IL-4為特征性細(xì)胞因子，分別由Th1、Th2細(xì)胞分泌，二者平衡，可反映促炎和抗炎的平衡情況。

有研究示，取LPS、FNLP經(jīng)腹腔注射后，肺濕重與干重比、肺伊文斯藍(lán)浸出量、肺病理改變均提示成功建立ALI模型[10]。對脾細(xì)胞中IL-4、IFN-γ變化進(jìn)行觀察，結(jié)果相較對照組，BLAB/C小鼠在ALI時，脾細(xì)胞中IFN-γ呈近60%的下降，而檢測IL-4，呈4倍多的升高。此與蔣雄斌等[10]報(bào)道一致，但I(xiàn)L-4升高更為明顯。

IFN-γ、IL-4是反映Th1及Th2平衡變化的典型細(xì)胞因子，此種變化表明，在ALI發(fā)生時，Th1漂移至Th2。目前研究顯示，Th1飄移至Th2，與下列因素可能相關(guān)。（1）LPS結(jié)合單核巨噬細(xì)胞表面CD14受體，對TNFα、IL-1等炎癥細(xì)胞因子釋放，同時伴隨大量抑制介質(zhì)前列腺素E2的釋放，經(jīng)PGF2依賴性通道，促使Th細(xì)胞向Th2表型明確轉(zhuǎn)化。PGE2可對Th1合成IFN-γ、IL-2明顯抑制，卻對Th2生成IL-4不影響[11]。（2）與炎癥介質(zhì)IL-6、IL-1、TNF-α的釋放伴發(fā)，糖皮質(zhì)激素有增加表現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可對Th1細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄抑制因子合成增加產(chǎn)生刺激，此因子與核因子結(jié)合，促使復(fù)合物形成，從而對炎癥細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄阻止[12]。此外，糖皮質(zhì)激素，可影響炎癥細(xì)胞因子相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。

對脾細(xì)胞中的IFN-γmRNA表達(dá)進(jìn)一步觀察得出，ALI時IFN-γmRNA表達(dá)下降明顯，IL-4m RNA表達(dá)量顯著升高。提示ALI時，可在mRNA水平上使促炎細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)抑制，抗炎細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)增加，從而引發(fā)促炎、抗炎失衡。

Th1向Th2飄移，表明抗炎癥反應(yīng)在ALI發(fā)生時，呈增強(qiáng)趨勢，而抗炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)，誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫功能出現(xiàn)低下。故可通過對Th1、Th2平衡變化檢測，選擇適當(dāng)?shù)臅r機(jī)，針對免疫功能低下，采

取有效的免疫調(diào)節(jié)措施，使促炎、抗炎平衡恢復(fù)，對ALI進(jìn)行防治。促炎與抗炎反應(yīng)失衡，為誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)生的本質(zhì)原因，對促炎與抗炎反應(yīng)失衡準(zhǔn)確評估有較大難度[13]。T輔助淋巴細(xì)胞可反映機(jī)體炎癥反應(yīng)的免疫功能狀態(tài)。

在受到嚴(yán)重的創(chuàng)傷之后，傷口是容易感染的，而在感染之后，傷口處容易出現(xiàn)各種病毒和細(xì)菌，會嚴(yán)重?fù)p害人們的身體健康。相關(guān)研究結(jié)果證明，急性肺損傷與體內(nèi)炎癥反應(yīng)不平衡相關(guān)，會導(dǎo)致機(jī)體促炎、抗炎反應(yīng)不平衡[14]。機(jī)體內(nèi)各類脾細(xì)胞當(dāng)中，存在很多促炎細(xì)胞和抗炎細(xì)胞，比如干擾素和白介素等，只有保證這兩種因子平衡，才能保證兩種細(xì)胞平衡[15]。當(dāng)發(fā)生急性肺損傷，機(jī)體炎癥反應(yīng)規(guī)律是不明確的，各種細(xì)胞的反應(yīng)情況也是不明確的，本文主要通過對急性肺損傷小鼠的功能試驗(yàn)研究，反應(yīng)急性肺損傷機(jī)體炎癥反應(yīng)情況。

相關(guān)研究結(jié)果表明，在急性肺損傷研究當(dāng)中，觀察機(jī)體炎癥反應(yīng)是比較重要的，因?yàn)樵诜螕p傷的過程中，會產(chǎn)生傷口感染從而引起傷口炎癥出現(xiàn)[16]。因此，通過肺損傷相關(guān)部位抗炎反應(yīng)及能力的檢測和觀察，就可以判斷急性肺損傷病情。本文主要通過小鼠淋巴細(xì)胞試驗(yàn)，對小鼠急性肺損傷的相關(guān)平衡因子和基因表達(dá)功能進(jìn)行檢測，最終發(fā)現(xiàn)，機(jī)體抗炎反應(yīng)在急性肺損傷中的作用非常大，而T輔助淋巴細(xì)胞對小鼠體內(nèi)這種抗炎反應(yīng)的調(diào)節(jié)和控制作用也比較大，在急性肺損傷疾病臨床研究中的意義比較大。急性肺損傷機(jī)體抗炎反應(yīng)主要表現(xiàn)為單核細(xì)胞的有效受體結(jié)合、抗炎因子的生成和細(xì)胞免疫因子的生成、IFN-γ和IL-4兩大因子的有效合成和轉(zhuǎn)化、IL-10因子的生成和增加、糖皮質(zhì)激素的不斷增加及脾細(xì)胞因子的異常轉(zhuǎn)錄等[17]。經(jīng)過對小鼠體內(nèi)T輔助淋巴細(xì)胞功能變化的有效觀察可以判斷急性肺損傷小鼠的病理學(xué)變化情況，急性肺損傷小鼠脾細(xì)胞mRNA表達(dá)能力比正常小鼠弱很多，證明抗炎反應(yīng)是導(dǎo)致急性肺損傷的主要原因。

本研究結(jié)果表明觀察組小鼠上清液當(dāng)中IFN-γ的含量明顯比對照組低，IL-4含量卻比對照組高，且經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄測定結(jié)果顯示，觀察組小鼠體內(nèi)脾細(xì)胞IFN-γ基因表達(dá)能力明顯比對照組低，以上比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表明當(dāng)發(fā)生急性肺損傷后，小鼠會產(chǎn)生明顯的抗炎癥反應(yīng)，T輔助淋巴細(xì)胞的功能變化在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展中的作用比較大。

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