李金城,鮑長俊,孫 云,莊永亮,孫麗平

(昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)

美味牛肝菌(Boletusedulis)對鎘(Ⅱ)的生物富集特性研究

李金城,鮑長俊,孫 云,莊永亮*,孫麗平

(昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)

本文研究了美味牛肝菌液體發(fā)酵對不同濃度鎘(Ⅱ)(Cd2+,0、16、32、48、64、80 mg/L)的生物富集特性。結(jié)果表明,Cd2+處理顯著抑制了美味牛肝菌菌絲體的生長(p<0.05),生長抑制率為50%的Cd2+濃度為56 mg/L。菌絲體對Cd2+的生物富集量可高達3335.7 mg/kg DW,富集系數(shù)為52.1(p<0.05)。菌絲體中可溶性總糖和多糖含量隨Cd2+濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,Cd2+處理菌絲體中的多糖含量均高于無Cd2+組(p<0.05);菌絲體中可溶性蛋白含量隨Cd2+濃度的升高先降低后上升,80 mg/L Cd2+處理組顯著高于無Cd2+組(p<0.05)。Cd2+處理對菌體過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性呈現(xiàn)顯著的“低促高抑”的影響趨勢(p<0.05),而過氧化物酶(POD)活性被顯著抑制(p<0.05)。表明美味牛肝菌對Cd2+具有很強的生物富集能力,可能是菌體的特定成分如多糖、蛋白等協(xié)同抗氧化酶系增強了菌體對Cd2+的耐受性和富集性能。

美味牛肝菌,鎘,生物富集,食品安全性

美味牛肝菌(Boletusedulis),俗稱白牛肝、大腳菇,屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、牛肝菌科,是一種世界范圍內(nèi)分布的食藥兼用的真菌。美味牛肝菌在云南的產(chǎn)量很高,具有很高的經(jīng)濟價值。據(jù)報道,美味牛肝菌營養(yǎng)價值很高[1],富含多糖等功能性物質(zhì)[2],能增強機體免疫力,具抗腫瘤、抗突變、降血脂、抗病毒等功效。然而,近年來環(huán)境重金屬污染日益嚴(yán)重,美味牛肝菌對鎘具有很強的生物富集能力和耐受性[3]。本項目組對云南省野生食用菌重金屬含量的初步調(diào)研,也發(fā)現(xiàn)了很多鎘含量超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)的美味牛肝菌樣本,個別菌株鎘含量達到7.35 mg/kg DW,雖然遠遠低于Collin-Hansen等[4]報道的由挪威鋅礦區(qū)采集的美味牛肝菌中的126 mg·kg-1DM,但是具有潛在的食品安全隱患。

美味牛肝菌對鎘的富集,一方面影響了其食品安全性,需要對其進行有效的質(zhì)量和安全控制;另一方面,提示可探索對重金屬具有高富集能力和耐受性的蕈菌,在環(huán)境的生物治污方面具有重要意義。因此,需要研究美味牛肝菌對鎘的生物富集特性,為上述兩點的研究提供理論基礎(chǔ)。研究表明,重金屬脅迫下,植物和真菌的首要防御系統(tǒng)是胞壁多糖、一些金屬結(jié)合蛋白、及其抗氧化酶系等[5]。美味牛肝菌對鎘的生物富集機制可能也與菌體內(nèi)的特定成分及其抗氧化酶系有關(guān)。目前尚未見此類的研究報道。本項目在實驗室可控培養(yǎng)條件下,針對鎘(Ⅱ)(Cd2+)對美味牛肝菌菌絲體液體發(fā)酵性能及其主要成分含量的影響,以及菌絲體對Cd2+的生物富集性能進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美味牛肝菌(Boletusedulis) 購于中科院微生物菌種保藏中心,PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯20%,葡萄糖2%,瓊脂2%,pH自然)活化。實驗用水為超純水;鎘元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL) 購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心;過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(可見光法)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(羥胺法)、過氧化物酶(POD)測定試劑盒(紫外法) 購于南京建成生物工程研究所;瓊脂和葡萄糖,生物培養(yǎng)用試劑 購于sigma;其它為分析純試劑。

YXQ-LS-30SH型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 江蘇凈化設(shè)備有限公司;QYC-2012C震蕩培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;TU-1901雙光束紫外可見光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;AAS400G型原子吸收光譜儀 德國耶拿;3k15型冷凍離心機 德國sigma。

1.2 實驗方法

1.2.1 美味牛肝菌實驗室的可控培養(yǎng) 制備PDA液體培養(yǎng)基,滅菌,接活化菌種,27 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d,得種子液。

根據(jù)本研究預(yù)實驗得到的菌絲生長半數(shù)抑制率的Cd2+濃度,設(shè)置培養(yǎng)基中Cd2+濃度為0、16、32、48、64、80 mg/L。將制備好的種子液打碎,按3%接種量接種于Cd2+濃度為0、16、32、48、64、80 mg/L的250 mL的三角瓶中(每個三角瓶裝液量100 mL PDA液體培養(yǎng)基),重復(fù)6次,27 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d,抽濾,大量超純水沖洗后,每瓶菌絲體發(fā)酵生物量以凍干后的重量計。得到的菌絲體分為2組,一組直接用于胞內(nèi)抗氧化酶系活性分析;另一組真空冷凍干燥,稱量菌絲干重,研碎,保存于干燥器備用。

1.2.2 菌絲體中鎘元素含量測定 參考GB/T 5009.15-2003《食品中鎘的測定的方法》,測定凍干后菌絲體中鎘含量。

1.2.3 菌絲體中可溶性總糖含量測定及菌絲體多糖含量分析 準(zhǔn)確稱取凍干的菌絲體20 mg,加入5 mL水,90 ℃震蕩提取2 h,3500 r/min離心10 min,取上清;沉淀加5 mL水重復(fù)提取一次,離心合并上清液,定容,采用苯酚-硫酸法測定菌體可溶性總糖含量,0～100 μg/mL的葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。

準(zhǔn)確稱取凍干的菌絲體10 g,加入100 mL水,90 ℃震蕩提取2 h,3500 r/min離心10 min,取上清;沉淀加100 mL水重復(fù)提取一次,離心合并上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積后加入4倍體積無水乙醇,4 ℃醇沉過夜,5000 r/min離心10 min,取沉淀復(fù)溶至一定體積后Savage法除蛋白,取水層凍干,得到菌絲體多糖提取物,復(fù)溶至一定體積后采用苯酚-硫酸法測定菌體多糖含量,0～100 μg/mL的葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。

1.2.4 菌絲體中CAT、SOD、POD活性及可溶性蛋白含量測定 準(zhǔn)確稱取3 g新鮮菌絲,按1∶3的比例加入0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7.0),一小勺石英砂,冰浴研磨勻漿,4 ℃冷凍離心(3500 r/min,10 min),取上清液作為CAT、SOD、POD活性及可溶性蛋白質(zhì)含量的待測液。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 每個實驗至少六次重復(fù),測定結(jié)果表達為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用Microsoft Office Excel 2007和origin7.5進行數(shù)據(jù)處理、作圖及回歸分析。采用SPSS11.5軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析,差異顯著性水平為α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cd2+對美味牛肝菌菌絲生長的影響

鎘(Ⅱ)對美味牛肝菌菌絲體生長發(fā)育的影響如圖1所示。在無Cd2+培養(yǎng)基中,美味牛肝菌長勢很好,濾出的菌絲體色白,呈明顯且均勻的絲狀。不同濃度Cd2+處理顯著抑制了美味牛肝菌菌絲體的生長發(fā)育(p<0.05),且濾出的菌絲體隨Cd2+濃度的增加顏色呈淡黃至黃褐色。這可能是Cd2+脅迫下,美味牛肝菌菌絲產(chǎn)生了黑色素,來螯合菌體中的Cd2+,提高菌絲體對Cd2+的耐受性[7]。培養(yǎng)結(jié)束后,無Cd2+培養(yǎng)基平均每瓶菌絲發(fā)酵產(chǎn)量為0.65 g,隨著Cd2+的加入,菌絲發(fā)酵產(chǎn)量逐漸減少,如圖1所示,本研究與前期研究結(jié)果一致[8]。將Cd2+處理濃度(X)與美味牛肝菌菌絲體發(fā)酵產(chǎn)量(Y)進行回歸分析得到Y(jié)=-0.0048X+0.592(R2=0.9283),即Cd2+對菌絲體生長發(fā)育的抑制作用與其濃度線性正相關(guān),生長抑制率為50%的Cd2+濃度為56 mg/L,表明美味牛肝菌對Cd2+具有較高的耐受性。

圖1 Cd2+對美味牛肝菌菌絲體生長發(fā)育的影響Fig.1 Effect of Cd2+ on the growth of Boletus edulis注：標(biāo)注不同字母表示差異顯著(p<0.05)，圖2～圖4同。

2.2 菌絲體對Cd2+的生物富集作用

如圖2所示,不同濃度Cd2+的液體培養(yǎng)基中,美味牛肝菌菌絲體對Cd2+的生物富集量呈“S”形曲線變化。由圖2可以看出,隨著培養(yǎng)基中Cd2+濃度的增加,菌絲體對Cd2+的富集量快速上升,其富集系數(shù)在Cd2+添加較低濃度時(16 mg/L)達到第一個峰值,為48.8,菌絲對Cd2+的富集量為780.2 mg/kg DW。在培養(yǎng)基中Cd2+濃度為64 mg/L時,菌絲體對Cd2+的富集量達到最大值,為3335.7 mg/kg DW,其富集系數(shù)也達到最大值,為52.1,其后,隨培養(yǎng)基中Cd2+濃度的增加,菌絲體對Cd2+的吸附量不再顯著增加,即達到飽和吸附,吸附量為3408.9 mg/kg DW。

根據(jù)目前的一些研究,大型真菌在活體生長過程中,菌絲體對培養(yǎng)基質(zhì)中重金屬的生物吸附性能顯著高于子實體[3,7],但是遠遠低于將采獲后的子實體作為生物吸附劑對基質(zhì)中重金屬的生物吸附能力[9]。這可能是菌絲體作為子實體的營養(yǎng)體,其與重金屬結(jié)合的大分子物質(zhì),如多糖、蛋白等含量較高;但是活體培養(yǎng)最終會受到重金屬損傷而產(chǎn)生體內(nèi)重金屬平衡機制,使其對重金屬的生物吸附具有較低的飽和度。但是以采獲后子實體作為生物吸附劑,處理基質(zhì)中的重金屬不再受活體的重金屬生理平衡機制的影響,從而具有較高的吸附飽和度。

圖2 美味牛肝菌菌絲發(fā)酵對培養(yǎng)基中Cd2+的生物富集性能Fig.2 Accumulation capacity and bioconcentration factor(BCF)of Cd2+ in Boletus edulis

2.3 Cd2+對菌絲體中可溶性總糖、可溶性蛋白含量及菌體多糖含量的影響

不同濃度Cd2+處理顯著影響了美味牛肝菌菌絲體中可溶性總糖、可溶性蛋白和菌體多糖的含量(p<0.05),如圖3所示。美味牛肝菌菌體中可溶性總糖含量較高,無Cd2+培養(yǎng)的菌絲體中達到25.3% DW;隨著Cd2+的加入及其濃度的增加,菌體中可溶性總糖含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在Cd2+濃度為16 mg/L時,菌體中可溶性總糖含量最高(p<0.05),為33.9% DW,Cd2+濃度為80 mg/L時菌體總糖含量則顯著降低為18.4% DW(p<0.05)。

Cd2+處理對菌體中可溶性蛋白含量的影響與總糖完全相反,由圖3可以看出,隨Cd2+濃度的增加,菌體中可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢,即Cd2+濃度為16 mg/L時菌體中可溶性蛋白含量最低(p<0.05),為0.9 mg/g FW;Cd2+濃度為80 mg/L時菌體可溶性蛋白含量顯著增加為1.6 mg/g FW(p<0.05),相比較于無Cd2+組的1.0 mg/g FW,增加了1.6倍。

Cd2+處理對菌體中多糖含量的影響也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,相對于可溶性總糖含量,菌體多糖在48 mg/L Cd2+處理時含量最高,為3.9% DW。無Cd2+添加時,菌絲體中多糖含量最低,為2.4% DW,所以培養(yǎng)基中Cd2+的存在刺激了美味牛肝菌菌體多糖的合成。

菌體中可溶性糖類主要包括葡萄糖、果糖、麥芽糖以及能夠在測定條件下水解為單糖的可溶性低聚糖,是菌體細(xì)胞中的主要能量物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),可以直接參與菌絲體的新陳代謝,從營養(yǎng)學(xué)角度,也是菌體供給人體的主要營養(yǎng)物質(zhì)和功能性成分;而多糖成分中一部分是菌體的初級代謝產(chǎn)物,一部分是次級代謝產(chǎn)物。重金屬對真菌可溶性總糖含量的影響未見報道,程顯好等[10]研究發(fā)現(xiàn)鋅對蛹蟲草菌體中葡萄糖含量的影響呈先增后降的趨勢,鋅處理量很高時菌體葡萄糖的含量要顯著低于無鋅組;王松華等[11]發(fā)現(xiàn)高濃度鎘處理顯著降低了靈芝菌絲體中還原性糖含量?？赡茉诮饘俣竞ψ饔孟?菌體生長發(fā)育受到抑制,從而抑制了菌體的新陳代謝進程。對此作用機理還有待進一步研究。

菌體多糖如幾丁質(zhì)、纖維素、纖維素衍生物等細(xì)胞成分能結(jié)合菌體吸附的重金屬,對菌體抗金屬脅迫的耐受性具有顯著積極作用[7]。另一方面,菌體多糖一般具有顯著的抗氧化活性,可有效清除自由基,維持細(xì)胞氧化壓力的平衡。重金屬存在下,可以刺激胞內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧,增加細(xì)胞氧化壓力,對細(xì)胞產(chǎn)生毒害。推測,Cd2+刺激美味牛肝菌菌體多糖的合成有助于平衡胞內(nèi)氧壓。所以,金屬離子的存在一般可以刺激菌體多糖的合成。

重金屬脅迫下,所有的生命體都存在生物轉(zhuǎn)化來降低重金屬的毒性,如誘導(dǎo)產(chǎn)生金屬硫蛋白、脅迫蛋白來螯合、穩(wěn)定進入體內(nèi)的重金屬。本研究中,Cd2+處理濃度較高,梯度跨度大,沒有觀察到低劑量的Cd2+對可溶性蛋白的誘導(dǎo)效應(yīng),所以可溶性蛋白呈現(xiàn)了先降后增的變化趨勢。對于很高濃度Cd2+處理刺激菌體中可溶性蛋白含量的增加,其機理還有待于進一步研究。

圖3 Cd2+對美味牛肝菌菌絲體中可溶性總糖、可溶性蛋白及菌體多糖含量的影響Fig.3 Effects of Cd2+ on the total soluble saccharides,soluble protein and polysaccharides

2.4 Cd2+對菌絲體中CAT、SOD、POD活力的影響

不同濃度Cd2+處理顯著影響了美味牛肝菌菌絲體中CAT、SOD和POD的活性(p<0.05),如圖4所示。CAT和SOD活性隨Cd2+處理濃度的增加呈現(xiàn)顯著的“低促高抑”變化(p<0.05),Cd2+濃度為16 mg/L時CAT和SOD活性均達到最大值。對于CAT活性,Cd2+處理濃度高于16 mg/L以后,其活性均顯著低于無Cd2+組(p<0.05);對于SOD活性,Cd2+處理濃度高于32 mg/L以后,其活性維持于無Cd2+處理組相當(dāng);POD活性被Cd2+顯著抑制(p<0.05)。

鎘脅迫可使生物細(xì)胞活性氧水平升高,造成活體細(xì)胞的氧壓損傷。生物細(xì)胞內(nèi)的CAT、SOD、PPO等抗氧化酶系可在一定程度上平衡各種環(huán)境因子造成的氧化迸發(fā),降低氧壓損傷,提高生物體抗逆性。重金屬作為生物體不利的環(huán)境因子之一,其脅迫下一般可刺激生物體抗氧化酶系活性升高,清除過量的活性氧,先前研究[11-12]先后報道了鎘脅迫下靈芝、柱狀田頭菇等真菌菌絲體中抗氧化酶系的響應(yīng),均可發(fā)現(xiàn)較低鎘濃度處理時對菌體抗氧化酶系的激活作用。推測,菌體抗氧化酶系活性升高,協(xié)同可溶性蛋白、菌體多糖等可提高菌體對重金屬脅迫的耐受性能。本研究中POD活性隨Cd2+處理的顯著降低,可能是本研究中Cd2+處理濃度太大,沒有觀察到Cd2+處理對POD活性的激活作用。

圖4 Cd2+對美味牛肝菌菌絲體中CAT、SOD和POD活性的影響Fig.4 Effects of Cd2+ on the activities of CAT,SOD and POD

3 結(jié)論

目前對于生物的金屬離子富集甚至超富集作用機制還不完全了解。從本文和已有研究來看,大型真菌對重金屬具有一定的生物富集作用和耐受性。

菌體中特定的物質(zhì)成分,如多糖、菌體蛋白等可參與重金屬的吸附,對重金屬脅迫造成的氧化壓力損傷具有一定的修復(fù)作用。菌體中的抗氧化酶系可被重金屬脅迫激活,協(xié)同菌體多糖和蛋白等提升菌體對重金屬的耐受性能。重金屬脅迫下大型真菌抗性機理是十分復(fù)雜的,其耐受性能可能是由多個基因調(diào)控,還需從細(xì)胞、分子水平上作進一步研究。

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Bioconcentration characteristics of Cadmium(Ⅱ)byBoletusedulis

LI Jin-cheng,BAO Chang-jun,SUN Yun,ZHUANG Yong-liang*,SUN Li-ping

(Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

The bioconcentration characteristics of cadmium(Ⅱ)with different concentrations(Cd2+,0,16,32,48,64 and 80 mg/L)byBoletusedulisunder liquid fermentation were investigated. The results showed that the treatment with increasing Cd2+concentrations significantly inhibited mycelia growth(p<0.05),and 50% inhibitory concentration was 56 mg/L. Mycelia showed significant accumulation capacity for Cd2+,with the highest content of 3335.7 mg Cd per kg mycelia(DW),and the bioconcentration factor was 52.1(p<0.05). The contents of total soluble sugars and polysaccharides in mycelia were increased firstly and then decreased with increasing Cd2+concentrations. The content of polysaccharides in mycelia treated with Cd2+significantly higher than that of control(p<0.05). Soluble protein contents were decreased firstly and then increased with increasing Cd2+concentrations,with the peak at 80 mg/L Cd2+(p<0.05). The activities of CAT and SOD were significantly increased by lower Cd2+concentrations but inhibited by high Cd2+concentrations(p<0.05). The activities of POD were significantly inhibited by Cd2+treatment(p<0.05).

Boletusedulis;cadmium;bioconcentration;food safety

2015-03-16

李金城(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)與安全，E-mail：340198516@qq.com。

*通訊作者:莊永亮(1981-)，男，博士，教授，主要從事食品高值化利用及質(zhì)量控制研究，E-mail：kmylzhuang@163.com。

國家自然科學(xué)基金項目(21267013)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)23-0068-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.005