劉振山等

摘要：

鈣蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin，CAST）專一抑制鈣蛋白酶（Calpain，CAPN）活性，參與調(diào)節(jié)牛肉的嫩化及肌內(nèi)蛋白的水解，其編碼基因是肉質(zhì)性狀的主要候選基因。本研究根據(jù)牛CAST基因5′UTR區(qū)（GenBank No. AY834771）和3′UTR區(qū)（GenBank No. DQ991097）序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，用PCR-SSCP方法對(duì)魯西黃牛和渤海黑牛共305個(gè)樣本進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性分析。結(jié)果顯示，CAST基因5′UTR和3′UTR區(qū)存在PCR-SSCP多態(tài)，在5′UTR區(qū)存在6437（C/T）、6477（G/A）和6614（G/T）3個(gè)SNP位點(diǎn)，表現(xiàn)為AA、AB、BB、BC和AD 5種基因型；在3′UTR區(qū)存在359（T/C）和366（A/G）2個(gè)SNP位點(diǎn)，表現(xiàn)為EE、EF、FF和EG 4種基因型。經(jīng)檢驗(yàn)表明，魯西黃牛和渤海黑牛均處于非Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；群體遺傳多態(tài)性分析表明這兩種牛的多態(tài)信息含量均為中度多態(tài)。

關(guān)鍵詞：魯西黃牛；渤海黑牛；CAST基因；5′UTR；3′UTR；單核苷酸多態(tài)性

中圖分類號(hào)：S823.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2015）03-0108-05

Polymorphism Analysis on 5′UTR and 3′UTR

of CAST Gene from Beef Cattle

Liu Zhenshan，Liu Guifen，Song Enliang，Liu Xiaomu，Tan Xiuwen，Wan Fachun*

（Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial

Key Laboratory of Animal Disease Control and Animal Breeding，Jinan 250100，China）

AbstractCalpastatin （CAST） is a protein inhibitor that acts specifically on calpains （CAPN） and plays a regulatory role in postmortem beef tenderization and muscle proteolysis，and its encoding gene was considered to be a main candidate gene for meat quality traits. Based on the published bovine CAST 5′UTR（GenBank No. AY834771）and 3′UTR（GenBank No. DQ991097） sequence， two pairs of primers were designed，and the single nucleotide polymorphisms of the two regions of CAST gene in Luxi（n=160）and Bohai black cattle（n=145）were analyzed by PCR-SSCP technique. The results showed that 3 SNPs at 6437（C/T）、6477（G/A）and 6614（G/T）and 5 genotypes（AA，AB，BB，BC and AD）were detected in CAST 5′UTR， and 2 SNPs at 359（T/C） and 366（A/G） and 4 genotypes（EE，EF，F(xiàn)F and EG）were detected in CAST 3′UTR. A chi-square analysis suggested that the allele frequencies and genotype frequencies of CAST gene were not in Hardy-Weinberg equilibrium， and statistical analysis revealed an intermediate PIC in Luxi and Bohai black cattle.

Key wordsLuxi cattle；Bohai black cattle；CAST gene；5′UTR；3′UTR；SNPs

牛肉嫩度是牛肉食用品質(zhì)的一個(gè)重要感官特征，也是決定肉品質(zhì)量的主要因素，多年來一直是國內(nèi)外肉品科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。影響肉嫩度的因素很多，包括肌節(jié)的長度、結(jié)締組織的含量、肌原纖維蛋白的降解程度、畜體的年齡、糖酵解的速度、pH值、可溶性膠原蛋白等。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)肌原纖維蛋白的降解做了大量研究，發(fā)現(xiàn)肉中存在的鈣蛋白酶系統(tǒng)對(duì)肌肉在成熟過程中的嫩化起一定的調(diào)控作用，是肌原纖維蛋白降解的限速步驟，這引起了科研人員的廣泛關(guān)注。

鈣蛋白酶系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)普遍存在，參與細(xì)胞的一系列進(jìn)程，包括生長、凋亡、遷移和細(xì)胞周期等[1]，該系統(tǒng)包括鈣蛋白酶（Calpain，CAPN）、鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）和鈣蛋白酶激活蛋白（Calpain Activator），三者相互作用，通過參與肌原纖維蛋白的降解過程影響肌肉生長及嫩化[2]。

鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）是鈣蛋白酶系統(tǒng)的一個(gè)重要成員，是細(xì)胞內(nèi)高效、需Ca2+的內(nèi)源性專一抑制CAPN活性的蛋白質(zhì)，它可以識(shí)別CAPN與鈣結(jié)合引起的構(gòu)象變化并與之特異性結(jié)合，通過抑制CAPN的自溶對(duì)其進(jìn)行抑制調(diào)節(jié)，從而調(diào)節(jié)肌肉內(nèi)蛋白的水解速率[3]。endprint

研究證實(shí)，CAST基因是家畜肉質(zhì)尤其是嫩度性狀的候選基因。對(duì)豬CAST基因的研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型的肌肉除肌內(nèi)脂肪和背膘厚差異顯著外[4]，其嫩度、屠宰45 min后pH值和滴水損失也存在顯著差異[5，6]；CAST基因?qū)﹄u肌纖維密度和直徑有著顯著的影響[7]；對(duì)牛的研究也發(fā)現(xiàn)，CAST不同基因型與該酶的活性、胴體性狀及牛肉剪切值相關(guān)[8，9]

魯西黃牛和渤海黑牛是山東省主要的地方黃牛品種，它們具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)嫩且蛋白質(zhì)豐富、遺傳性穩(wěn)定等優(yōu)良的生物學(xué)特性。本試驗(yàn)以魯西黃牛和渤海黑牛為研究對(duì)象，利用PCR-SSCP方法分析CAST基因單核苷酸多態(tài)性（SNP），旨在加快我國地方肉牛肉質(zhì)改良并為育種工作提供可靠的標(biāo)記輔助選擇手段。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以山東地方品種魯西黃牛和渤海黑牛為研究對(duì)象，數(shù)量分別為160頭和145頭。靜脈采血，血樣EDTA抗凝，置于冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2基因組DNA的制備

牛血樣基因組DNA的提取采用常規(guī)酚氯仿抽提法[10]，提取后的DNA用TE緩沖液溶解后，經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計(jì)測定濃度后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物合成

試驗(yàn)所用CAST-5′UTR和CAST-3′UTR引物分別根據(jù)CAST基因5′UTR序列（GenBank No. AY834771）和3′UTR序列（GenBank No. DQ991097），應(yīng)用Primer 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)，由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。引物序列、PCR產(chǎn)物大小及退火溫度詳見表1。

1.4PCR擴(kuò)增反應(yīng)

PCR擴(kuò)增體系由7.5 μL 2×Easy Taq PCR SuperMix （TransGen Biotech Co.， Ltd， Beijing， China）、6.4 μL ddH2O、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、0.1 μL模板DNA（50 ng/μL）組成，共15 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性30 s、退火30 s、72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min，最后4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5PCR-SSCP法檢測單核苷酸多態(tài)性

取4 μL PCR產(chǎn)物和8 μL loading buffer [95%去離子甲酰胺、1 mmol EDTA （pH 8.0）、0.025%二甲苯菁、0.025%溴酚藍(lán)、10%甘油]，98℃變性10 min，迅速放入碎冰中，冰浴15 min，使之保持單鏈狀態(tài)。然后將冰浴的變性混合樣在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Bis=29∶1）中電泳。先進(jìn)行200 V、10 min的高壓電泳，后120 V電泳15 h，銀染顯色。

1.6測序

經(jīng)SSCP分析后，挑選特異性較好的呈現(xiàn)多態(tài)的PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行純化后測序。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)的等位基因頻率（Allele frequency）、基因型頻率（Genotype frequency）、遺傳純合度（Homozygosity）、遺傳雜合度（Heterozygosity， He）、有效等位基因數(shù)（Effective number of alleles， Ne）和多態(tài)信息含量（Polymorphism information content， PIC），對(duì)位點(diǎn)基因型的分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡的卡方適合性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)不同品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每對(duì)引物的擴(kuò)增片段與目的片段大小一致，且條帶清晰，特異性好，可直接用于SSCP分析（圖1）。

M：Marker；1、2：不同牛個(gè)體

因此，該位點(diǎn)的突變是同義突變。

2.4不同肉牛品種CAST基因型頻率和基因頻率分析

從遺傳學(xué)角度統(tǒng)計(jì)了CAST基因5′UTR和3′UTR區(qū)PCR-SSCP位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率（見表2、表3），可以看出，在魯西黃牛和渤海黑牛群體中，CAST-5′UTR以等位基因A、B為主，基因頻率在0.4281～0.5438，CAST-3′UTR以等位基因E、F為主，基因頻率在0.4594～0.5250。適合性χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，魯西黃牛和渤海黑牛均處于非Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

多態(tài)信息含量（PIC）和雜合度（He）都是評(píng)價(jià)群體內(nèi)遺傳多態(tài)性的一個(gè)指標(biāo)，不同品種牛各位點(diǎn)純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)及多態(tài)信息含量分析結(jié)果見表4?？梢钥闯觯珻AST基因在魯西黃牛和渤海黑牛兩個(gè)群體中的多態(tài)信息含量都處于中度多態(tài)，可以作為有效的遺傳標(biāo)記用于山東地方黃牛遺傳多樣性分析。

3討論

肉品質(zhì)改良成為當(dāng)今畜禽遺傳育種界的研究熱點(diǎn)之一。在保持肉牛生長速度的基礎(chǔ)上不斷改善牛肉質(zhì)量一直是肉牛育種的主要目標(biāo)，但牛肉性狀的形成是諸多因素參與的復(fù)雜過程，并與生長速度存在負(fù)相關(guān)，目前尚沒有一種切實(shí)可行的解決方案。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用候選基因策略尋找影響牛肉肉質(zhì)性狀的主效基因或與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，并將MAS和MAI策略應(yīng)用于肉質(zhì)改良，從遺傳基礎(chǔ)上講是可行的，也因此成為研究熱點(diǎn)之一。

鈣蛋白酶蛋白系統(tǒng)是一個(gè)高度可調(diào)的依賴于鈣離子的蛋白水解酶系統(tǒng)，在細(xì)胞內(nèi)普遍存在，在肌肉組織中，它位于肌纖維Z盤附近和肌質(zhì)網(wǎng)膜上，控制著肌纖維蛋白的降解，是肌肉蛋白質(zhì)降解的限速步驟[11]。鈣蛋白酶抑制蛋白在鈣蛋白酶系統(tǒng)中扮演著重要的作用，Pringle等試驗(yàn)證實(shí)，嫩度與鈣蛋白酶抑制蛋白/μ-calpain的活性比值關(guān)系顯著，活性比值越大，鈣蛋白酶抑制蛋白的量相對(duì)越大，對(duì)蛋白酶的抑制作用越強(qiáng)，則肉的嫩度越好[12]。Melody等研究表明，鈣蛋白酶及其抑制蛋白與肌肉發(fā)育之間存在著密切關(guān)系，鈣蛋白酶抑制蛋白能提高肌肉的嫩度，而肌原纖維又占成熟骨骼肌蛋白重量的50%～60%，所以通過調(diào)節(jié)鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白的活性可調(diào)節(jié)肌肉的發(fā)育，從而提高家畜的瘦肉率和產(chǎn)出率，提高肌肉的質(zhì)量[13]。Geesink等研究認(rèn)為，高水平的鈣蛋白酶抑制蛋白能夠抑制宰后肌肉蛋白的水解和嫩化，而且這種抑制作用是間接性的[14]。endprint

研究發(fā)現(xiàn)，CAST基因是影響牛肉嫩度的主要候選基因，定位于7號(hào)染色體上[15]，相對(duì)位置為117.8 cM[16]，基因全長約為130 kb，包含35個(gè)外顯子，其中外顯子2的上游有5個(gè)外顯子[17]。CAST基因有4個(gè)啟動(dòng)子，編碼為4個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型，它們主要是在5′端不同。Schenkel等研究發(fā)現(xiàn)CAST基因內(nèi)含子5的一個(gè)SNP位點(diǎn)與胴體品質(zhì)及肉質(zhì)相關(guān)[18]。鄧桂馨等研究也發(fā)現(xiàn)CAST基因內(nèi)含子6的SNP位點(diǎn)與牛肉嫩度顯著相關(guān)[19]。

真核生物mRNA的5′UTR和3′UTR區(qū)的功能復(fù)雜多樣，5′UTR保護(hù)mRNA免遭5′端外切酶降解，為mRNA的核輸出提供轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)，提高翻譯模板的穩(wěn)定性和翻譯效率；3′UTR不僅能調(diào)控其mRNA的穩(wěn)定性、控制mRNA的亞細(xì)胞定位，而且還在特定氨基酸的編碼過程中起指導(dǎo)作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，CAST 5′UTR區(qū)的DdeI多態(tài)位點(diǎn)和瘤牛及其與黃牛雜交后代的牛肉剪切值（SF）及肌原纖維斷裂指數(shù)（MFI）相關(guān)[21]；Casas等研究發(fā)現(xiàn)CAST 3′UTR區(qū)的G/A多態(tài)位點(diǎn)與牛肉的嫩度顯著相關(guān)[22，23]，可見牛CAST基因5′UTR和3′UTR區(qū)對(duì)其基因功能起重要的作用。本研究克隆了魯西黃牛和渤海黑牛CAST基因5′UTR及3′UTR序列，并分析了這兩段的多態(tài)性，得到5個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，這些多態(tài)位點(diǎn)是否調(diào)節(jié)CAST基因的表達(dá)還需要進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)僅對(duì)兩個(gè)地方品種牛CAST基因多態(tài)性作了初步的探索，需要通過擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究CAST基因的多態(tài)性。同時(shí)，記錄不同品種、不同個(gè)體的肉質(zhì)性狀，進(jìn)一步分析基因多態(tài)性與生產(chǎn)性能的關(guān)系，尋找與肉質(zhì)性狀QTL相連鎖的標(biāo)記，通過MAS檢測與標(biāo)記連鎖的目標(biāo)基因，進(jìn)行目的基因型選擇。本研究得到的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為今后肉牛肉質(zhì)性狀的研究提供一定的分子基礎(chǔ)。同時(shí)，不同肉牛品種中CAST基因多態(tài)性位點(diǎn)的分布也為我們進(jìn)一步揭示遺傳多樣性提供了新的遺傳標(biāo)記。

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